Normele din 11 martie 2002

Anexa 1 ──────── la norma sanitară veterinara ───────────────────────────── CERTIFICAT DE SĂNĂTATE A ANIMALELOR pentru importul de material seminal provenit de la bovine ┌──────────────────────────────────────────┬───────────────────────────────────┐ │1. Expeditor (numele și adresa completa) │ Numărul certificatului │ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │ │2. Țara terta a colectării │ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │3. Destinatar (numele și adresa completa) │4. Autoritatea sanitară veterinara │ │ │ competența │ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │ │5. Autoritatea sanitară veterinara │ │ │ competența locală │ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │6. Locul încărcării │7. Numele și adresa centrului de │ │ │ colectare a materialului seminal│ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │8. Mijlocul de transport │11. Numărul de autorizare a │ ├──────────────────────────────────────────┤ centrului de colectare a │ │9. Locul și țara de destinație │ materialului seminal │ ├──────────────────────────────────────────┤ │ │10. Numărul sigiliului containerelor cu │ │ │ material seminal │ │ ├──────────────────────────────────────────┤ │ │12. Identificarea materialului seminal │ │ │ proaspăt sau congelat*) │ │ ├─────────────────────────┬────────────────┴───────────┬───────────────────────┤ │a) Numărul de doze │b) Data (datele) colectării │ c) Rasa │ ├─────────────────────────┤ ├───────────────────────┤ │d) Identificarea │ │ │ │ animalului donator │ │ │ └─────────────────────────┴────────────────────────────┴───────────────────────┘ *) A se anula, după caz. 13. Subsemnatul ......., medic veterinar oficial, am citit și imi este cunoscută Directiva Consiliului 88/407/CEE și certific ca: a) .........(denumirea tarii exportatoare)...... a fost indemna de pesta bovina și febra aftoasa pe o perioadă de 12 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export și până la data de expediere a sa, în cursul aceleiași perioade nu s-a efectuat nici o vaccinare împotriva acestor boli; ... b) centrul de colectare a materialului seminal în care a fost colectat materialul seminal ce urmează să fie exportat a fost: ... (i) autorizat conform condițiilor stabilite în cap. I din anexa A la Directiva Consiliului 88/407/CEE ; (îi) condus și supravegheat conform condițiilor stabilite în cap. II din anexa A la Directiva Consiliului 88/407/CEE ; (iii) indemn de rabie, tuberculoza, bruceloza, antrax și pleuropneumonia contagioasa bovina pe o perioadă de 30 de zile înainte de data colectării materialului seminal ce trebuie exportat și de 30 de zile după data colectării (în cazul materialului seminal proaspăt până în ziua expedierii); c) bovinele care se găsesc la centrul de colectare a materialului seminal: ... (i) provin din efective și/sau au fost fatate de mame care îndeplinesc condițiile prevăzute la cap. I din anexa B la Directiva 88/407/CEE ; (îi) au fost supuse, înainte de a intră în izolare, testelor solicitate conform cap. I din anexa B la Directiva 88/407/CEE ; (iii) au respectat cerințele de izolare înainte de intrare și pe cele de testare stabilite conform cap. I din anexa B la Directiva 88/407/CEE ; (iv) au fost ținute cel puțin un an și au fost supuse testelor de rutina conform cap. II din anexa B la Directiva 88/407/CEE ; (d) materialul seminal ce trebuie exportat: (i) a fost obținut de la donatori care au fost ținuți în .........(denumirea tarii exportatoare).......... o perioadă de 6 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export și care satisfac condițiile stabilite în anexa C la Directiva 88/407/CEE ; (îi) a fost obținut de la donatori care: 1. se găsesc într-un centru de colectare a materialului seminal în care toate bovinele, în cursul a 12 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export, au fost supuse, cu rezultate negative, unui test de seroneutralizare sau unui test Elisa pentru rinotraheita infectioasa bovina/vulvovaginita pustuloasa infectioasa*1); sau ──────────── *1) Se anulează, după caz. 2. au reactionat negativ la un test de seroneutralizare sau la un test Elisa pentru rinotraheita infectioasa bovina/vulvovaginita pustuloasa infectioasa, efectuat într-o perioadă de 12 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export; sau 3. sunt seropozitivi, fiind vaccinati în concordanta cu cap. II din anexa B la Directiva Consiliului 88/407/CEE și având un rezultat negativ la un test de seroneutralizare sau la un test Elisa, efectuat înainte de vaccinare în centrul de colectare a materialului seminal aprobat; (iii) a fost prelucrat, depozitat și transportat în condiții care îndeplinesc prevederile Directivei 88/407/CEE . Întocmit la ...(locul)....., la ....(data)......... ┌───────────┐ Semnatura*1) ........................................... │Ștampila*1)│ Numele și prenumele (cu majuscule) ..................... └───────────┘ Titlul oficial ......................................... ──────────── *1) Semnatura și ștampila trebuie să fie de o culoare diferita de cea a tipariturii

Anexa 2 ──────── la norma sanitară veterinara ──────────────────────────── CERTIFICAT DE SĂNĂTATE A ANIMALELOR pentru importul de material seminal provenit de la bovine din Statele Unite ale Americii ┌──────────────────────────────────────────┬───────────────────────────────────┐ │1. Expeditor (numele și adresa completa) │ Numărul certificatului │ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │ │2. Țara terta a colectării │ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │3. Destinatar (numele și adresa completa) │4. Autoritatea sanitară veterinara │ │ │ competența │ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │ │5. Autoritatea sanitară veterinara │ │ │ competența locală │ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │6. Locul încărcării │7. Numele și adresa centrului de │ │ │ colectare a materialului seminal│ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │8. Mijlocul de transport │11. Numărul de autorizare a │ ├──────────────────────────────────────────┤ centrului de colectare a │ │9. Locul și țara de destinație │ materialului seminal │ ├──────────────────────────────────────────┤ │ │10. Numărul sigiliului containerelor cu │ │ │ material seminal │ │ ├──────────────────────────────────────────┤ │ │12. Identificarea materialului seminal │ │ │ proaspăt sau congelat*) │ │ ├─────────────────────────┬────────────────┴───────────┬───────────────────────┤ │a) Numărul de doze │b) Data (datele) colectării │ c) Rasa │ ├─────────────────────────┤ ├───────────────────────┤ │d) Identificarea │ │ │ │ animalului donator │ │ │ └─────────────────────────┴────────────────────────────┴───────────────────────┘ *) A se anula, după caz. 13. Subsemnatul ............, medic veterinar oficial, am citit și imi sunt cunoscute prevederile Ordinului ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 , publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 111 din 11 februarie 2002, și certific ca: a) ......./(denumirea tarii exportatoare) ........ a fost indemna de pesta bovina și febra aftoasa într-o perioadă de 12 luni imediat înainte de colectarea materialului seminal pentru export și până la data de expediere a sa și în cursul aceleiași perioade nu s-a efectuat nici o vaccinare împotriva acestor boli; ... b) centrul de colectare a materialului seminal în care a fost colectat materialul seminal ce urmează să fie exportat a fost: ... (i) autorizat conform prevederilor Ordinului ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (îi) condus și supravegheat conform prevederilor Ordinului ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (iii) indemn de rabie, tuberculoza, bruceloza, antrax și pleuropneumonia contagioasa bovina pe o perioadă de 30 de zile înainte de data colectării materialului seminal ce trebuie exportat și de 30 de zile după colectare (în cazul materialului seminal proaspăt până în ziua expedierii); c) bovinele care se găsesc la centrul de colectare a materialului seminal: ... (i) provin din efective și/sau au fost fatate de mame care îndeplinesc condițiile prevăzute de Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (îi) au fost supuse, înainte de a intră în izolare, testelor prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (iii) au respectat cerințele de izolare înainte de intrare și pe cele de testare stabilite în Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (iv) au fost ținute cel puțin un an și au fost supuse testelor de rutina conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; d) materialul seminal ce trebuie exportat: ... (i) a fost obținut de la donatori care au fost ținuți în ......../(denumirea tarii exportatoare)......... o perioadă de 6 luni imediat înainte de colectarea materialului seminal pentru export, și care îndeplinesc condițiile prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (îi) a fost obținut de la donatori care: 1. se găsesc într-un centru de colectare a materialului seminal în care toate bovinele, în cursul a 12 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export, au fost supuse, cu rezultate negative, unui test de seroneutralizare sau unui test Elisa pentru rinotraheita infectioasa bovina/vulvovaginita pustuloasa infectioasa*1); sau ────────── *1) Se anulează, după caz. 2. reactioneaza negativ la un test de seroneutralizare sau un test Elisa pentru rinotraheita infectioasa bovina/vulvovaginita pustuloasa infectioasa, efectuat într-o perioadă de 12 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export; sau 3. sunt seropozitivi, fiind vaccinati conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 și având un rezultat negativ la un test de seroneutralizare sau la un test Elisa, efectuat înainte de vaccinare în centrul de colectare a materialului seminal aprobat; (iii) a fost prelucrat, depozitat și transportat conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (iv) a fost obținut de la tauri donatori care au fost supuși de doua ori, la interval de cel mult 12 luni, înainte și după colectare, la următoarele teste, cu rezultate negative, într-un laborator autorizat (testarea după colectare trebuie să fie efectuată pe o proba de sânge prelevata cu nu mai puțin de 21 de zile după colectarea materialului seminal pentru export): 1. un test Elisa competitiv pentru febra catarala, conform anexei nr. 5 la prezenta norma sanitară veterinara; 2. un test de imunodifuzie în gel de agar conform anexei nr. 5 la prezenta norma sanitară veterinara și un test de neutralizare pentru toate serotipurile virusului bolii hemoragice epizootice cunoscute ca existând în țara exportatoare. Întocmit la ...(locul)....., la ....(data)......... ┌───────────┐ Semnatura*1) ........................................... │Ștampila*1)│ Numele și prenumele (cu majuscule) ..................... └───────────┘ Titlul oficial ......................................... ──────────── *1) Semnatura și ștampila trebuie să fie de o culoare diferita de cea a tipariturii

Anexa 3 ──────── la norma sanitară veterinara ──────────────────────────── CERTIFICAT DE SĂNĂTATE A ANIMALELOR pentru importul de material seminal provenit de la bovine ┌──────────────────────────────────────────┬───────────────────────────────────┐ │1. Expeditor (numele și adresa completa) │ Numărul certificatului │ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │ │2. Țara terta a colectării │ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │3. Destinatar (numele și adresa completa) │4. Autoritatea sanitară veterinara │ │ │ competența │ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │ │5. Autoritatea sanitară veterinara │ │ │ competența locală │ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │6. Locul încărcării │7. Numele și adresa centrului de │ │ │ colectare a materialului seminal│ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │8. Mijlocul de transport │11. Numărul de autorizare a │ ├──────────────────────────────────────────┤ centrului de colectare a │ │9. Locul și statul membru de destinație │ materialului seminal │ ├──────────────────────────────────────────┤ │ │10. Numărul sigiliului containerelor cu │ │ │ material seminal │ │ ├──────────────────────────────────────────┤ │ │12. Identificarea materialului seminal │ │ │ proaspăt sau congelat*) │ │ ├─────────────────────────┬────────────────┴───────────┬───────────────────────┤ │a) Numărul de doze │b) Data (datele) colectării │ c) Rasa │ ├─────────────────────────┤ ├───────────────────────┤ │d) Identificarea │ │ │ │ animalului donator │ │ │ └─────────────────────────┴────────────────────────────┴───────────────────────┘ *) A se anula, după caz 13. Subsemnatul ......., medic veterinar oficial, am citit și imi sunt cunoscute prevederile Ordinului ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 , publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 111 din 11 februarie 2002, și certific ca: a) ......./(denumirea tarii exportatoare)...... a fost indemna de pesta bovina și febra aftoasa într-o perioadă de 12 luni imediat înainte de colectarea materialului seminal pentru export și până la data de expediere a sa și în cursul aceleiași perioade nu s-a efectuat nici o vaccinare împotriva acestor boli; ... b) centrul de colectare a materialului seminal în care a fost colectat materialul seminal ce urmează să fie exportat a fost; ... (i) autorizat conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (îi) condus și supravegheat conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (iii) indemn de rabie, tuberculoza, bruceloza, antrax și pleuropneumonia contagioasa bovina o perioadă de 30 de zile înainte de data de colectare a materialului seminal ce trebuie exportat și de 30 de zile după colectare (în cazul materialului seminal proaspăt până în ziua expedierii); c) bovinele care se găsesc la centrul de colectare a materialului seminal: ... (i) provin din efective și/sau au fost fatate de mame care îndeplinesc condițiile prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (îi) au fost supuse, înainte de a intră în izolare, testelor prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (iii) au respectat cerințele de izolare înainte de intrare și pe cele de testare prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (iv) au fost ținute pentru cel puțin un an, au fost supuse testelor de rutina, conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 și cap. II din anexa B la Directiva 88/407/CEE ; d) materialul seminal ce trebuie exportat: ... (i) a fost obținut de la donatori care au fost ținuți în ........./(denumirea tarii exportatoare)...... o perioadă de 6 luni imediat înainte de colectarea materialului seminal pentru export și care îndeplinesc condițiile prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (îi) a fost obținut de la donatori care: 1. se găsesc într-un centru de colectare a materialului seminal în care toate bovinele, în cursul a 12 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export, au fost supuse, cu rezultate negative, unui test de seroneutralizare sau unui test Elisa pentru rinotraheita infectioasa bovina/vulvovaginita pustuloasa infectioasa*1); sau 2. au reactionat negativ la un test de seroneutralizare sau la un test Elisa pentru rinotraheita infectioasa bovina/vulvovaginita pustuloasa infectioasa, efectuat într-o perioadă de 12 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export; sau 3. sunt seropozitivi, fiind vaccinati conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 , având un rezultat negativ la un test de seroneutralizare sau la un test Elisa, efectuat înainte de vaccinare, în centrul de colectare a materialului seminal aprobat; (iii) a fost prelucrat, depozitat și transportat conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (iv) a fost obținut de la tauri donatori care, fie: 1. se găseau în centrul autorizat de colectare a materialului seminal la data de 1 iulie 1994; fie 2. au fost introdusi în centrul autorizat după data de 1 iulie 1994, fiind supuși, cu rezultate negative, următoarelor teste pentru febra catarala și boala hemoragica epizootica, într-un laborator autorizat, înainte de a intră în centru și în orice caz au fost supuși semestrial, cu rezultate negative, următoarelor teste, într-un laborator autorizat: - test Elisa competitiv pentru febra catarala conform anexei nr. 5 la prezenta norma sanitară veterinara; - test de imunodifuzie în gel de agar, conform anexei nr. 5 la prezenta norma sanitară veterinara și test de neutralizare pentru toate serotipurile virusului bolii hemoragice epizootice găsite în țara exportatoare. Întocmit la ...(locul)....., la ....(data)......... ┌───────────┐ Semnatura*2) ........................................... │Ștampila*2)│ Numele și prenumele (cu majuscule) ..................... └───────────┘ Titlul oficial ......................................... ──────────── *1) Se anulează, după caz. *2) Semnatura și ștampila trebuie să fie de o culoare diferita de cea a tipariturii

Anexa 4 ──────── la norma sanitară veterinara ──────────────────────────── CERTIFICAT DE SĂNĂTATE A ANIMALELOR pentru importul de material seminal provenit de la bovine ┌──────────────────────────────────────────┬───────────────────────────────────┐ │1. Expeditor (numele și adresa completa) │ Numărul certificatului │ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │ │2. Țara terta a colectării │ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │3. Destinatar (numele și adresa completa) │4. Autoritatea sanitară veterinara │ │ │ competența │ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │ │5. Autoritatea sanitară veterinara │ │ │ competența locală │ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │6. Locul încărcării │7. Numele și adresa centrului de │ │ │ colectare a materialului seminal│ ├──────────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤ │8. Mijlocul de transport │11. Numărul de autorizare a │ ├──────────────────────────────────────────┤ centrului de colectare a │ │9. Locul și statul membru de destinație │ materialului seminal │ ├──────────────────────────────────────────┤ │ │10. Numărul sigiliului containerelor cu │ │ │ material seminal │ │ ├──────────────────────────────────────────┤ │ │12. Identificarea materialului seminal │ │ │ proaspăt sau congelat*) │ │ ├─────────────────────────┬────────────────┴───────────┬───────────────────────┤ │a) Numărul de doze │b) Data (datele) colectării │ c) Rasa │ ├─────────────────────────┤ ├───────────────────────┤ │d) Identificarea │ │ │ │ animalului donator │ │ │ └─────────────────────────┴────────────────────────────┴───────────────────────┘ *) A se anula, după caz. 13. Subsemnatul, ........, medic veterinar oficial, am citit și imi sunt cunoscute prevederile Ordinului ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 și certific ca: a) ......../(denumirea tarii exportatoare).... a fost indemna de pesta bovina și febra aftoasa într-o perioadă de 12 luni imediat înainte de colectarea materialului seminal pentru export și până la data de expediere a sa și în cursul aceleiași perioade nu s-a efectuat nici o vaccinare împotriva acestor boli; ... b) centrul de colectare a materialului seminal în care a fost colectat materialul seminal ce urmează să fie exportat a fost: ... (i) autorizat conform prevederilor Ordinului ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (îi) condus și supravegheat conform prevederilor Ordinului ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (iii) indemn de rabie, tuberculoza, bruceloza, antrax și pleuropneumonia contagioasa bovina o perioadă de 30 de zile înainte de data colectării materialului seminal ce trebuie exportat și de 30 de zile după colectare (în cazul materialului seminal proaspăt până în ziua expedierii); c) bovinele care se găsesc la centrul de colectare a materialului seminal: ... (i) provin din efective și/sau au fost fatate de mame care îndeplinesc condițiile prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (îi) au fost supuse, înainte de a intră în izolare, testelor prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (iii) au respectat cerințele de izolare înainte de intrare și pe cele de testare, prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (iv) au fost ținute cel puțin un an și au fost supuse testelor de rutina, conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; d) materialul seminal ce trebuie exportat: ... (i) a fost obținut de la donatori care au fost ținuți în ......./(denumirea tarii exportatoare).... o perioadă de 6 luni imediat înainte de colectarea materialului seminal pentru export și care îndeplinesc condițiile prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (îi) a fost obținut de la donatori care: 1. se găsesc într-un centru de colectare a materialului seminal în care toate bovinele, în cursul a 12 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export, au fost supuse, cu rezultate negative, unui test de seroneutralizare sau unui test Elisa pentru rinotraheita infectioasa bovina/vulvovaginita pustuloasa infectioasa*1); sau 2. au reactionat negativ la un test de seroneutralizare sau la un test Elisa pentru rinotraheita infectioasa bovina/vulvovaginita pustuloasa infectioasa, efectuat pe perioada a 12 luni înainte de colectarea materialului seminal pentru export; sau 3. sunt seropozitivi, fiind vaccinati, conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 , având rezultat negativ la un test de seroneutralizare sau la un test Elisa, efectuat în centrul aprobat de colectare a materialului seminal înainte de vaccinare; (iii) a fost prelucrat, depozitat și transportat conform Ordinului ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 353/2001 ; (iv) a fost obținut de la tauri donatori care au fost supuși de doua ori, la interval de cel mult 12 luni, înainte și după colectare, la următoarele teste, cu rezultate negative, într-un laborator autorizat (testul în urma colectării trebuie să fie efectuat pe o proba de sânge prelevata cu nu mai puțin de 21 de zile după colectarea materialului seminal pentru export): 1. un test Elisa competitiv pentru febra catarala, conform anexei nr. 5 la prezenta norma sanitară veterinara; 2. un test de imunodifuzie în gel de agar, conform anexei nr. 5 la prezenta norma sanitară veterinara și un test de neutralizare pentru toate serotipurile virusului bolii hemoragice epizootice cunoscute ca existând în țara exportatoare. 3. un test seroneutralizare pentru virusul Akabane. Întocmit la ....../(locul)......, la .../(data)..... ┌───────────┐ Semnatura*2) .................................... │Ștampila*2)│ Numele și prenumele (cu majuscule) .............. └───────────┘ Titlul oficial .................................. ────────────── *1) Se anulează, după caz. * 2) Semnatura și ștampila trebuie să fie de o culoare diferita de cea a tipariturii

Anexa 5 ──────── la norma sanitară veterinara ────────────────── PROTOCOL pentru un test Elisa competitiv "test de imunoabsorbtie cu legătură enzimatica", test utilizând anticorpi monoclonali specifici de grup pentru detectarea anticorpilor virusului febrei catarale Test competitiv Elisa pentru febra catarala, utilizând anticorpul monoclonal 3-17-A3 Testul este capabil sa detecteze anticorpi față de toate serotipurile cunoscute ale virusului febrei catarale "VFC". Principiul testului este întreruperea reacției dintre antigenul VFC și un anticorp monoclonal specific de grup "3-17-A3" prin adăugarea de dilutii ale serului de testat. Anticorpii VFC prezenți în serul de testat blocheaza reactivitatea anticorpului monoclonal "AcM" și rezultă o atenuare a schimbării asteptate a culorii în momentul adaugarii substratului enzimatic. Materiale și reagenti 1. Plăci de microtitrare cu fund plat 2. Antigen: preparat în modul descris mai jos 3. Tampon de blocare: lapte praf deshidratat "Marvel" 5% "w/v", Tween-20 0,1% "v/v" "furnizat ca soluție de polioxietilena sorbiton monolaurat" în soluție salina tamponata - fosfat "PBS" 4. Anticorp monoclonal 3-17-A3 "furnizat ca supernatant de cultura tisulara hibridoma" depozitat la temperatura de -20°C sau liofilizat, diluat 1/50, cu tampon de blocare înainte de utilizare, dirijat contra polipeptidei p7 specifică de grup 5. Conjugat: globulina de iepure antisoarece "absorbită și eluata", conjugata cu peroxidaza de hrean și păstrată la intuneric la temperatura de 4°C 6. Substrat și cromogen: 0,2 g de ortofenilen-diamina "OFD" dizolvată într-un tampon constând în 2,553 g acid citric și 4,574 g di-sodium hidrogenortofosfat adus la 500 ml cu apa distilata, împărțită în cote-părți de 25 ml și păstrată la intuneric la temperatura de -20°C, cu 12 f2æl/25 ml de peroxid de hidrogen "30% w/v" adăugat imediat înainte de utilizare A se manipula OFD cu precautii - a se purta manusi din cauciuc - suspect de a fi mutagen 7. Acid sulfuric 1 M: 26,6 ml de acid adăugat la 474,4 ml apa distilata Atenție - Întotdeauna se adauga acid în apa, niciodată apa în acid 8. Agitator orbital 9. Cititor de plăci Elisa - testul poate fi citit vizual Protocol de testare

Protocol de testare
H G F E D C B A
Martor
Antigen + conjugat
1
Controlul AcM
2
Controlul pozitivelor Antigen + AcM + conjugat 3
Antigen + ser pozitiv + AcM + conjugat
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256
Seruri de testat
Seruri de testat 1/2 1/4 1/8 1/16 1/2 1/4 1/8 1/16 4
5
6
7
8
9
10
11
12 Protocol de testare Controlul martorului Rândul 1A-H reprezintă un control al martorului constând în antigen VFC și conjugat. Acesta poate fi utilizat pentru a etalona cititorul Elisa. Controlul AcM Rândul 2A-H reprezintă controlul anticorpului monoclonal și consta în antigen VFC, anticorp monoclonal și conjugat. Acesta reprezintă un control negativ. Media citirilor densitatilor optice pentru acest rând de control reprezintă valoarea de inhibitie 0%. Controlul pozitiv Rândul 3A-H reprezintă controlul pozitiv. Acesta consta în antigen VFC, dilutii ale antiserului pozitiv VFC, AcM și conjugat. Acesta este inclus ca un indicator al faptului ca testul funcționează corespunzător și ca de la test la test trebuie să fie obținute niveluri similare de inhibitie. Seruri de testat În schema de testare prezentată mai sus pot fi testate 18 seruri la o rata a dilutiei de 1/2, 1/4, 1/8, 1/16. Aceasta va da unele indicații asupra titrului de anticorpi în serul de testat. Aceasta gama de dilutii poate fi extinsă ulterior pentru a se obține titruri finale ale dilutiei serului. În mod alternativ, pentru studiile serologice la scara mare, serurile pot fi testate la o dilutie unica de 1/4 sau la doua dilutii de 1/2 și 1/4 ca un test de control rapid. Procedura 1. Se dilueaza antigenul VFC cu concentrație pretitrata în PBS, se agita pentru scurt timp folosindu-se baia de ultrasunete pentru a dispersa virusul agregat, iar "dacă baia de ultrasunete nu este disponibilă, se pipeteaza viguros" și se adauga 50 f2æl în toate godeurile placii Elisa. Se lovesc ușor marginile placii pentru a dispersa antigenul. 2. Se incubeaza la temperatura de 37°C timp de 60 de minute într-un agitator orbital. Se spala plăcile de trei ori prin umplerea și golirea godeurilor cu PBS nesteril și se usucă cu hârtie absorbanta. 3. Se adauga 50 f2æl de tampon de blocare pentru fiecare godeu. Se adauga serurile de testat și serul pozitiv în godeurile corespunzătoare și se dilueaza pe suprafața placii utilizându-se o pipeta cu canale multiple. Nu se adauga ser în cazul controlului cu blanc sau controlului AcM. 4. Imediat după adăugarea serurilor de testat se dilueaza AcM în tamponul de blocare "cu dilutie pretitrata" și se adauga 50 ml în toate godeurile placii, cu excepția controlului cu blanc. 5. Se incubeaza la temperatura de 37°C timp de 60 de minute într-un agitator orbital. Se spala de trei ori cu PBS și se usucă. 6. Se dilueaza concentratul de globuline de iepure antisoarece la 1/5000 în tampon de blocare și se adauga 50 f2æl în toate godeurile placii. 7. Se incubeaza la temperatura de 37°C timp de 60 de minute într-un agitator orbital. Se spala de trei ori cu PBS și se usucă. 8. Se dezgheata OPD și imediat înainte de utilizare se adauga 12 f2æl din peroxid de hidrogen 30% la fiecare 25 ml de OPD. Se adauga 50 ml în toate godeurile placii. Se asteapta aproximativ 10 minute pentru a se modifica culoarea și se oprește reactia cu acid sulfuric 1M "50 f2æl/godeu". Culoarea trebuie să se modifice în godeurile de control al AcM și în acele godeuri care conțin seruri fără nici un anticorp VFC. 9. Se examinează și se înregistrează plăcile fie vizual, fie utilizându-se un cititor spectrofotometric. Analiza rezultatelor Se calculează media citirilor densitatilor optice "DO" plecandu-se de la controalele AcM. Aceasta reprezintă valoarea de inhibitie 0%. Citirile densitatii optice ale serurilor de testat sunt exprimate ca valori procentuale de inhibitie, utilizându-se următoarea formula: Valoarea procentuală = 100 - DO în prezenta serului de testat de inhibitie ──────────────────────────────── x 100 DO în absenta serului de testat Valorile de inhibitie mai mari de 40% la o dilutie a serului de 1/4 sunt considerate pozitive. Citirea vizuala este posibila dacă o inhibitie de 40% este cea mai mica valoare ușor vizibila cu ochiul liber. Prepararea antigenului VFC pentru tehnica Elisa 1. Se spala de 3 ori 10 plăci de celule confluente BHK-21 cu mediul Eagle's fără ser și se infecteaza cu serotipul 1 al virusului febrei catarale într-un mediu Eagle's fără ser. 2. Se incubeaza la temperatura de 37°C și se examinează zilnic pentru efectul citopatic "ecp". 3. Atunci când ecp este evident pe 80-90% din stratul de celule al fiecărei plăci, se recuperează virusul prin agitarea celulelor aderente de sticlă. 4. Se centrifugheaza la 2.000-3.000 rot./min. pentru a precipita celulele. 5. Se inlatura supernatantul și se resuspenda celulele în aproximativ 30 ml de PBS conținând 1% "Sarkosyl" și 2 ml de fluorura de fenilmetilsulfonil "tampon de liza". Aceasta poate determina celulele sa formeze un gel și se pot adauga mai multe tampoane de liza pentru a reduce acest efect. NOTĂ: Fluorura de fenilmetilsulfonil este dăunătoare - a se manipula cu prudenta extrema! 6. Se fragmenteaza celulele timp de 60 de secunde, folosindu-se o sonda ultrasonica la o amplitudine de 30 de microni. 7. Se centrifugheaza la 10.000 rot./min. timp de 10 minute. 8. Se depozitează supernatantul la temperatura de +4°C și se resuspenda celulele precipitate rămase în 10-20 ml de tampon de liza. 9. Se agita cu ajutorul unui aparat cu ultrasunete și se clarifica, depozitand supernatantul în fiecare etapa, în total de 3 ori. 10. Se reunesc supernatantii și se centrifugheaza la 24.000 rot./min. timp de 120 de minute la temperatura de 4°C pe un tampon de 5 ml de sucroza 40% "w/v în PBS", folosindu-se tuburi de centrifugare Beckmann de 30 ml și un rotor SW 28. 11. Se inlatura supernatantul, se dreneaza tuburile în întregime și se resuspenda granula de reziduu celular în PBS prin supunerea la ultrasunete. Se depozitează antigenul în cote-părți la -70°C. Titrarea antigenului VFC pentru tehnica Elisa Antigenul febrei catarale este titrat prin tehnica Elisa indirecta. Dilutii în baza doi de antigen sunt titrate față de o dilutie constanta "1/50" de anticorpi monoclonali 3-17-A3. Protocolul este după cum urmează: Procedura 1. Se dilueaza antigen VFC în PBS de-a lungul placii de microtitrare în serii de dilutii, în baza doi "50 f2æl/godeu", utilizându-se o pipeta cu canale multiple. 2. Se incubeaza timp de o ora la temperatura de 37°C într-un agitator orbital. 3. Se spala plăcile de trei ori cu PBS. 4. Se adauga 50 ml din anticorpul monoclonal 3-17-A3 "diluat 1/50" în fiecare godeu al placii de microtitrare. 5. Se incubeaza timp de o ora la temperatura de 37°C într-un agitator orbital. 6. Se spala plăcile de trei ori cu PBS. 7. Se adauga în fiecare godeu al placii de microtitrare 50 f2æl de globulina de iepure antisoarece conjugata la peroxidaza de hrean, diluata până la o concentrație optima pretitrata. 8. Se incubeaza o ora la temperatura de 37°C într-un agitator orbital. 9. Se adauga substrat și cromogen după cum s-a descris anterior. Se oprește reactia după 10 minute, prin adăugarea de acid sulfuric 1 M "50 f2æl/godeu". În testul concurent anticorpul monoclonal trebuie să fie în exces, de aceea se alege o dilutie de antigen care cade pe curba de titrare "nu pe zona platou", care da aproximativ 0,8 DO după 10 minute. Protocolul pentru testul de imunodifuzie pe gel de agar pentru detectarea anticorpilor bolii hemoragice epizootice Testul de imunodifuzie pe gel de agar este efectuat în concordanta cu următorul protocol: Materiale și reactivi 1. Antigen ────────── Antigenul care precipita este preparat în orice sistem de cultura celulara care susține multiplicarea rapida a serotipului "serotipurilor" virale corespunzătoare ale virusului bolii hemoragice epizootice. Sunt recomandate celulele BKH sau celulele Vero. Antigenul este prezent în fluidul supernatant la finalul creșterii virusului, dar pentru a fi eficient necesita o concentrare de la 50 până la 100 de ori. Aceasta poate fi realizată prin orice procedura standard de concentrare a proteinelor; virusul antigenului poate fi inactivat prin adăugarea de betapropiolactona 0,3% "v/v". 2. Serul de control pozitiv cunoscut ──────────────────────────────────── Utilizându-se serul internațional de referința și antigenul, este produs un ser standard național, standardizat pentru proporția optima față de serul internațional de referința, liofilizat și utilizat ca ser de control cunoscut în fiecare test. 3. Serul de testat ────────────────── Procedura 1. Agaroza 1% preparata în tampon de borat sau de barbitol de sodiu, pH de la 8,5 la 9,0, este turnata într-o placa Petri de o adancime minima de 3,0 mm. 2. Un sablon de testat din 7 godeuri lipsite de umiditate, fiecare cu un diametru de 5,0 mm, este tăiat în agar. Sablonul consta într-un godeu central și 6 godeuri aranjate în jurul lui într-un cerc cu o raza de 3 mm.
1
6
2
X
5
3
4
3. Godeul central este umplut cu antigenul standard. Godeurile periferice 2, 4 și 6 sunt umplute cu ser pozitiv cunoscut, iar godeurile 1, 3 și 5 sunt umplute cu seruri de testat. 4. Sistemul este incubat o perioadă de până la 72 de ore la temperatura camerei, într-o camera umeda închisă. Interpretare ──────────── Un ser de testat este pozitiv dacă formează o linie de precipitare specifică cu antigenul și formează o linie completa de identitate cu serul de control. Un ser de testat este negativ dacă nu formează o linie specifică cu antigenul și nu deviaza curba serului de control. Plăcile Petri trebuie să fie examinate pe fond intunecat și utilizându-se iluminare indirecta. ────────────────────