Metodologia din 26 martie 2005

Metodologia de evaluare a impactului substanțelor prioritare/prioritar periculoase asupra mediului acvatic stabilește efectul toxic al acestor substanțe asupra sistemelor biologice acvatice - alge verzi, dafnia, peștii - conține:
A. Metodologia de determinare a toxicității acute asupra algelor verzi;
B. Metodologia de determinare a toxicității acute asupra Dafniilor;
C. Metodologia de determinare a toxicității acute asupra peștilor;
D. Metodologia de determinare a toxicității cronice asupra peștilor.
Speciile precizate pentru, testele de toxicitate sunt specii comune sistemelor ecologice acvatice din România, astfel: alge verzi de tipul Scenedesmus quadricuada, Chlorella vulgaris dafnii de tipul Daphnia magna pești de tipul Cyprinus carpio.
A. Metodologia de determinare a toxicității acute asupra algelor verzi.
A. 1. Testul de inhibiție al algelor verzi
1. Caracteristici ale metodei
- determină efectele substanțelor asupra creșterii algelor verzi;
- permite evaluarea efectelor substanțelor la câteva generații în 72 de ore;
- poate fi utilizată pentru câteva tipuri de alge verzi unicelulare.
- ușor de aplicat pentru substanțele solubile în apă; la condițiile test, acestea rămân în apă.
- se folosește și pentru substanțele care nu interfera direct cu măsurarea creșterii algale.
- necesită cunoașterea proprietăților fizico-chimice ale substanței de testat - solubilitatea în apă, evaporare, stabilitate chimică, constantă de disociere, biodegradabilitate.
- la interpretarea rezultatelor ia în calcul diferite proprietăți ale substanței -formula, gradul de puritate, natura și procentul impurităților, prezența și cantitățile de aditivi, coeficientul de partiție n-octanol/apă.
2. Definitii
Densitate celulara: numărul de celule pe milimetru;
Creștere; creșterea densității celulare peste perioada test;
Rata de creștere: creșterea densității celulare pe unitatea de timp;
EC(50) - concentrația substanței care provoacă 50% reducere a creșterii celulare [E(b) C(50)] sau ratei de creștere [E(f) C(50)] față de celulele martor.
NOEC - concentrația cea mai mare la care nu se observă nici o inhibiție semnificativă a creșterii algale față de martor.
Unitate de măsură: greutate pe volum (mg/l) sau greutate pe greutate (mg. Kg^-1.
3. Substanța de referință
Substanța de referință poate fi testată ca un mijloc de demonstrație că în condițiile de laborator sensibilitatea speciei test nu se modifică semnificativ.
Dicromatul de K poate fi folosit ca substanță de referință.
4. Principiul metodei
O limită test poate fi realizată la 100 mg/l pentru a demonstra ca EC(50) este mai mare decât aceasta concentrație.
Creșterea exponențială a culturilor de alge verzi selectate expuse la diferite concentrații ale substanței test se obține în condiții bine determinate
Soluțiile test sunt incubate pe o perioadă de 72 h timp în care densitatea celulelor din fiecare soluție este măsurată la 24 h. Inhibiția creșterii algale este determinată față de martor.
5. Criterii de calitate
Densitatea celulară din cultura de control ar trebui să crească cu un factor de minim 16 în 3 zile.
Concentrațiile substanței test vor fi menținute la 80% față de concentrațiile inițiale tot timpul, corespunzător concentrației nominalizate.
Pentru substanțele care:
- sunt puțin solubile;
- capabile să formeze emulsii sau dispersii;
- nestabile;
se vor face soluții de fiecare dată.
6. Mod de lucru
Reactivi
Soluții cu substanțele test. În funcție de caracteristicile substanței se vor face soluții mamă.
Mediul test
Se folosește apă din rețea (trebuie cunoscută duritatea, pH), apă distilată sau apă deionizată.
Aparatura
Echipament normal de laborator;
Sticle Winkler de 250 ml;
Cameră de numărare:
Temoluminostat;
Agitator magnetic;
Microscop.
Organisme test
Dintre speciile de alge verzi recomandă Selenastrum capricornutum L, Scenedesmus subspicatus, Scenedesmus quadricauda L.
Procedura test
Șirul concentrațiilor, în care apar efectele, este determinat pe baza rezultatelor obținute de la mai multe serii experimentale. Două măsurători ale creșterii (biomasa, rata creșterii) rezultă în urma măsurătorilor larg dispersate ale inhibiției creșterii; ambele trebuie să fie utilizate în testul stabilirii de domeniu pentru ca progresia geometrică a concentrațiilor să permită estimarea atât a E(b) C(50) cât și E(r)E(50).
Densitatea celulară inițială
Densitatea celulară inițială trebuie să fie de aproximativ 10^4 cel/ml Selenastrum capricornutum sau Scenedesmus subspicatus sau Scenedesmus quadricauda. Când sunt folosite alte specii biomasa trebuie să fie comparabilă.
Concentrațiile substanței test
Pentru test se folosesc cel puțin 5 concentrații în serie geometrică, la o rata a concentrației care să nu depășească 2,2. La concentrațiile cele mai mici trebuie să ne se observe mici un efect asupra cresterii algale; cele mai mari concentrații trebuie să înhibe creșterea cu cel puțin 50% față de martor, în mod ideal trebuie să oprească complet creșterea.
Serii și control
Testele trebuie să includă 3 serii pentru fiecare concentrație, trei sticle de control fără substanță și dacă este necesar cu substanțele aditive.
Performanța testului
Culturile test conțin concentrații dorite de substanțe și inoculul cu alge verzi. Sticlele sunt agitate și luminate continuu. Temperatura trebuie să fie 21°-25° C +/- 2.
Densitatea celulara se măsoară la cel puțin 24 h, 48 h și 72 h de la începerea testului.
pH -ul se măsoară la începutul și sfârșitul testului. pH -ul de la testul de control nu trebuie să devieze mai mult de 1,5 unități în timpul testului.
Test limită
Folosind procedurile descrise în această metodă, o limită test poate fi executată la 100 mg/l pentru a demonstra că EC(50) este mai mare decât această concentrație.
Dacă natura substanței este de așa fel încât o concentrație de 100 mg/l în apă test nu poate fi atinsă, testul de limită trebuie să fie realizat la o concentrație egală cu solubilitatea substanței (sau concentrația maximă care formează o dispersie stabilă) în mediul utilizat.
Testul limită trebuie să fie realizat în cel puțin 3 serii experimentale cu același număr de control.
Celelalte măsurători ale creșterii - biomasa, rata creșterii - trebuie să fie utilizate pentru testul limită.
Dacă, într-un test limita se constată o scădere medie de 25% sau mai mult fie în biomasa fie în rata de creștere testul limită și testul de control, atunci trebuie făcut un nou test.
7. Evaluare și raportare
Valorile densității celulare din cultura test sunt trecute în tabel alături de concentrații și timpul când s-au facut măsurătorile. Valorile medii ale densității celulare pentru fiecare concentrație a substanței test și a martorului sunt reprezentate pe un sistem de coordinate în funcție de timp; se obține curba de creștere.
Pentru determinarea relației concentrație/efect trebuie utilizate 2 abordări. Unele substanțe pot stimula creșterea la concentrații mici, altele produc inhibiții între 0 și 100%.
Spațiul dintre curbele de creștere și linia orizontală N=No se calculează cu formula:
*Font9*
N(1)-N(o)
N(1)+N(2)-2N(o)
N(o-1)+N(o)+2N(o)
A = ────────── X t(1) + ───────────────x(t(2)-t(1)+....+ ──────────────── x [t(o)-t(o-1)]
2
2
2
Unde:
A = zona
N(o) = nr cel/ml la timpul t(o) (începutul testului)
N(1) = nr de celule măsurate / ml la t(1)
N(n) = nr de celule măsurate ml la t(n)
t(1) = timpul primei măsurători după începutul testului
t(n) = timpul ultimei măsurători după începutul testului
n - numărul de măsurători făcute după începutul testului
Procentul inhibiției creșterii celulare pentru fiecare concentrație a substanței [I(A)] este calculat cu formula:
A(c) - A(t)
I(A) = ────────── x 100
A(c)
Unde:
A(c)= zona dintre curba de creștere a martorului și linia orizontală N = N(o)
A(t) = zona dintre curba de creștere la concentrația t și linia orizontală N
= N(o)
I(A) = valoarea probit care este valoarea estimată de la linia de regresie
prin citirea concentrațiilor care este echivalentă cu 50% inhibiție
I(A) = 50%). Denotă că această valoare pentru această metodă de calcul este propusă ca să aibă simbolul
E(b) C(50) Este esențial ca
E(b) C(50) este fixată cu perioada de expunere adecvata de exemplu E(b) C(50)(0-72 h)
A. 2 Determinarea toxicității substanțelor față de algele verzi
1. Caracteristici ale metodei
- stabilește influența toxicității substanțelor prioritare/prioritar periculoase asupra procesului de fotosinteză al algelor verzi de tip Scenedesmus quadricauda L. și Chlorella vulgaris L;
- exclude erorile la citire. Metoda a fost pusă la punct de către ICIM și apoi a fost standardizată.
- testul se efectuează în două etape:
1. testul preliminar - în care se stabilește domeniul de concentrații necesar a fi experimentat;
2. testul final - ale cărui rezultat sunt înregistrate prelucrate și interpretate.
- se stabilește potențialul toxic al unor substanțe individuale sau în amestec față de reprezentanți ai producătorilor primari, alge verzi;
- rezultatele sunt folosite la stabilirea limitei maxime admisibile ale substanțelor în sistemele ecologice acvatice.
2. Principiul metodei
Se urmărește influența substanțelor asupra, intensității procesului de fotosinteză al algelor verzi, evidențiate prin reducerea producției de oxigen; producția de oxigen este determinată după 24 h, perioadă de timp în care probele an fost ținute în condiții constante de temperaturii și iluminare.
Procentele de modificare a producției de oxigen permit evaluarea gradului de toxicitate a substanței supusă testării, asupra organismului test.
Specii test: algele verzi - Scenedesmus quadricauda L și Chlorella vulgaris L provenite din cultura de laborator; acestea sunt specii comune sistemelor ecologice acvatice din țara noastră, răspund bine la presiunea exercitată de substanță și se întrețin relativ ușor în condiții de laborator.
3. Reactivi, sticlărie de laborator și materiale
Reactivii pentru determinarea oxigenului dizolvat în apă; metoda recomandată este STAS 6536.
Reactivii de precipitare: clorura de mangan sau sulfat de mangan, hidroxid de sodiu sau hidroxid de potasiu și ioduri de potasiu.
Reactivii de dizolvare și titrate: acid sulfuric, tiosulfat de potasiu și amidon.
Apa pentru diluții: apă aerată provenită din rețeaua de alimentare cu grad mijlociu de duritate (7°G - 8°G) și mineralizare redusă spre medie, de aproximativ 300 mg/l reziduu fix
Sticle pentru oxigen, tip Winkler, cu dop șlefuit și etanș, cu capacitate de 200...300 ml, etalonate cu precizie până la 0,1 ml;
Pipete de 1 ml și 2 ml cu diviziuni de câte 0,1 ml;
Biuretă de 50 ml și 100 ml;
Termoluminostat
4. Mod de lucru
Din cultura de alge se pregătește o suspensie de alge verzi, cu un conținut de aproximativ 5000 celule/ml și se repartizează câte 50 ml din acestea la 1000 ml soluție de testat. Se montează în sticle pentru oxigen, serii duble de probe, astfel:
- prima serie de probe conține apă de diluție + suspensie de alge + substanță toxică în diverse concentrații;
- a doua serie de probe conține apă de diluție + substanță toxică (în concentrații identice cu prima serie;
- se montează și 2 probe martor care conțin: apa de diluție, iar cealaltă apă de diluție + suspensie de alge
Se introduc toate probele în termoluminostat, menținându-se timp de 24 h la temperatura constantă de 20°C și iluminare permanentă de 4500 - 5000 lucsi.
După perioada de incubație se determină oxigenul dizolvat; metoda recomandată este STAS 6536.
5. Evaluarea toxicității substanței investigate și raportare
Se folosește următoarea formulă:
(OX + Ox) - (OB-Ob)
Delta x = 100 x ───────────────────
(OB-Ob)
unde :
Delta x = modificarea producției de O(2) prin fotosinteză exprimată în % la concentrația dată;
OB = concentrația O(2) din proba oarbă cu alge, după incubare;
Ob = concentrația O(2) din proba oarbă, fără alge, după incubare
OX = concentrația O(2) din proba conținând substanța toxică sau amestecul de substanțe și alge, după incubare;
Ox = concentrația O(2) din proba conținând substanța toxică sau amestecul de substanțe, fără alge, după incubare.
Valorile Delta x negative - indică o acțiune toxică a substanței date iar valorile Delta x pozitive - indică lipsa unei acțiuni toxice sau, în unele cazuri, ca substanța respectivă are rol nutritiv și compensează până la o anumita limita efectul toxic, conform figurii 1.
Fig. I. Caracteristicile producției de oxigen în cazul unei acțiuni toxice (curba III, IV), indiferente (curba I) și stimulatoare (curba II) a unei substanțe
B. Metodologie de determinare a toxicității acute asupra Dafniilor
Testul de toxicitate acută pentru Daphnia
1. Caracteristici ale metodei
- din modulul trofodinamic reprezentat de grupul mare al consumatorilor, metodologia utilizează dafniile și peștii;
- dafniile și peștii sunt bune indicatoare ale efectelor substanțelor prioritare/prioritar periculoase pentru poluarea acvatică;
- dafniile și peștii sunt componente ale sectorului de ciclare al substanțelor prioritare/prioritar periculoase din sistemele ecologice acvatice.
2. Definitii
EC(50) - LC(50) pentru dafnia.
Toxicitatea acută - concentrația medie efectivă [EC(50)] pentru imobilizare; acea concentrație care imobilizează 50% din organismele test în timpul perioadei test.
Imobilizare - numărul de animale care nu sunt capabile să înoate 15 secunde după o ușoară agitație în vasul test.
Unități de măsură: greutate/volum (mg/l) sau ca greutate/greutate (mg kg^-1).
Substantă de referință - o substanță de referință poate fi testată ca o metodă de a demonstra că în condiții de laborator sensibilitatea organismelor test nu este modificată semnificativ.
3. Principiul metodei
O limită test poate fi realizată la 100 mg/l pentru a demonstra că EC(50) este mai mare decât această concentrație.
Dafniile sunt expuse timp de 48 h la substanța adăugată în diferite concentrații în apă. Dacă timpul este mai scurt, trebuie să se precizeze în raport.
În condiții identice de test și concentrații de substanță adecvate, la diferite concentrații se vor obține diferite efecte asupra capacității de înot a dafniei. La concentrațiile care produc 0 sau 100% imobilizare în timp de 48 h se calculează EC(50) dacă este posibil.
Se folosește testul static.
4. Criterii de calitate
Imobilizarea organismelor martor nu trebuie să depășească 10% la sfârșitul testului.
Organismele test nu trebuie să fie la suprafața apei.
Se recomandă ca O(2) dizolvat din vasele test să fie peste 3 mgl^-1 și nu mai mic de 2 mgl^-1.
Concentrațiile substanței test vor fi menținute în vase la 80% din concentrațiile inițiale pe toată durata testului.
Pentru substanțele care:
- sunt puțin solubile;
- capabile să formeze emulsii sau dispersii;
- nestabile.
se vor face soluții de fiecare dată.
pH -ui nu trebuie să varieze mai mult de 1 unitate.
5. Mod de lucru
Reactivi
Soluțiile substanței test - se prepară în apa cunoscută sau apa distilată sau apa deionizată; se prepară soluția stoc, din care se fac concentrații diferite.
Aparatura
Vase de sticlă;
Oxigenometru;
Aparat pentru măsurarea temperaturii;
pH-metru;
Echipament pentru măsurarea duritații apei.
Organisme test
Se recomanda utilizarea Daphnia magna Straus. Se poate folosi și Daphnia pulex De Geer.
Organismele test trebuie să fie mai tinere de 24 h, la începutul testului
Procedura test
Se face un test preliminar pentru a alege scara de concentrații.
Expunerea dafniei se face astfel:
- durata: preferabil 48 h;
- număr de animale: mai puțin de 20 animale, de preferat 10;
- încărcare: cel puțin 2 ml de soluție test
- concentrația test; soluția test trebuie preparata înainte de introducerea dafniilor, preferabil fară introducerea altui solvent decât apa; concentrațiile se fac geometric, la o rată a concentrației ce nu depășește 2,2. Concentrațiile care dau 0% și 100% imobilizare după 48 h și un domeniu de grade de imobilizare intermediare care să permită calcularea EC(50) la 48 h trebuie să fie testate împreună cu martorul.
Apa
Lumina - ciclul lumina - întuneric opțional;
Temperatura - temperatura test trebuie să fie 18 - 22°C ± 1°C;
Aerate - nu este necesară;
Hrănire - pe durata testului nu se hrănesc.
pH -ul și O(2) se măsoară la începutul și sfârșitul testului;
Compușii volatili trebuie testați în vase închise, destul de largi pentru a preveni lipsa de O(2).
Dafniile sunt urmărite cel puțin 24 h și încă 48 h.
Test limită
Folosind procedurile descrise în această metodă, un test limită poate fi realizat la 100 mg/l pentru a demonstra că EC(50) este mai mare decât acea concentrație.
Dacă natura substanței este de așa fel încât o concentrație de 100 mg/l în apa test nu poate fi obținută, testul limită trebuie să fie executat la o concentrație egală cu solubilitatea substanței sau concentrația maximă care formează o dispersie stabilă în mediul utilizat.
Testul limită trebuie să folosească 20 dafnii, împărțite în 2 sau 4 grupe, cu același număr de martori; dacă apare imobilizarea trebuie repetat testul.
6. Evaluare și raportare
Pentru fiecare perioadă când se înregistrează observațiile, respectiv 24 și 48 h procentajul de mortalitate este punctat în dreptul concentrației pe hârtie milimetrică.
Pentru fiecare observație de timp, EC(50) și limită de confidență (p = 0,05) trebuie să fie estimate folosind procedurile standard; aceste valori trebuie rotunjite.
În acele cazuri când panta curbei concentrației răspuns este prea abruptă să permită calcularea EC(50), o estimare grafică a acestei valori este suficientă.
Când la 2 concentrații consecutive apropiate de rata 2,2, rata de imobilizare este numai de 0 și 100%, aceste 2 valori sunt suficiente pentru a indica domeniul în care cade EC(50).
Dacă se observă că stabilitatea sau omogenitatea substanței test nu poate fi menținută, aceasta trebuie înregistrată și luată în considerare în momentul interpretării rezultatelor.
Raportul va cuprinde următoarele informații:
- Informații despre organismele test - nume științific, tulpină, sursă, hrănire;
- Apa de diluție și caracteristicile importante - pH, temperatură, duritate;
- Metoda de preparare a stocului și soluțiilor test, pentru substanțele cu solubilitate mică în apă;
- Concentrațiile oricăror substanțe auxiliare;
- Lista concentrațiilor utilizate;
- Metode folosite și rezultatele obținute, dacă s-a efectuat analiza chimică;
- Rezultatele testului limită, dacă s-a făcut;
- Descrierea echipamentului test;
- Regimul de iluminare;
- Dacă au fost îndeplinite criteriile de calitate;
- Un tabel care să conțină numărul de dafnii imobilizate, concentrația, timpul;
- Graficul care reprezintă curba relației concentrație/răspuns la sfârșitul testului;
- Procedura statistică de determinare a valorii EC(50);
- Substanța de referință utilizată;
- Cea mai mare concentrație care nu a indus imobilizare în timpul perioadei test;
- Cea mai mica concentrație test care a provocat 100% imobilizare în perioada test
C. Metodologia de determinare a toxicității acute asupra peștilor
1. Caracteristici ale metodei
- determină toxicitatea acută letală a substanțelor pentru peștii din apele de suprafață;
- necesită cunoașterea proprietăților fizico-chimice ale substanțelor investigate: solubilitatea în apă, presiunea vaporilor, stabilitatea chimică, biodegradabilitatea, pentru selectarea celei mai adecvate metode test - statică, semi-statică sau curgere continuă - în scopul asigurării concentrațiilor constante de substanță pe toată durata testului;
- oferă informații referitoare la formula chimică, gradul de puritate, natura și procentele semnificative de impurități, prezența și cantitățile aditivilor, coeficientul de partiție n- octanol / apa, trebuie luate în considerare pentru organizarea testului și interpretarea rezultatelor.
2. Definiții
Toxicitate acută - decelarea efectelor negative asupra organismelor într-un timp scurt (96 h) în prezența substanței testate; se exprimă prin concentrația medie letală.
[CL(50)] - concentrația substanței din apa care omoară 50 % din peștii test într-o perioadă de expunere continuă.
Unități de măsură: exprimate în greutate / volum ( mg/l) sau greutate / greutate (mg/kg).
3. Principiul metodei
O limită test poate fi efectuată la 100 mg/l substanță pentru a demonstra că CL(50) este concentrația mai mare decât această concentrație.
Peștii sunt expuși la substanța test dizolvată în apă într-un șir convenabil de concentrații pentru o perioadă de 96 h; mortalitățile sunt înregistrate la intervale de cel puțin 24 h, iar concentrațiile ce omoară 50 % din pești [CL(50)] sunt necesare pentru fiecare observație.
4. Criterii de calitate
Mortalitățile la lotul de control nu trebuie să depășească 10 % (sau un pește dacă sunt folosiți mai puțin de 10) ta sfârșitul testului.
Saturația O(2) dizolvat trebuie să fie > 60 %.
Concentrațiile substanțelor test vor fi menținute până la 80 % din concentrația inițială pe toată durata testului.
Pentru substanțele care se dizolvă ușor în mediu sau sunt stabile, concentrația inițială este considerată fiind echivalentul concentrației nominale.
Se vor preciza concentrațiile folosite pe toata durata testului și ce condiții experimentale au fost îndeplinite.
Pentru substanțe care:
- au solubilitate redusă în mediu test;
- sunt capabile să formeze emulsii sau dispersii stabile;
- sunt nestabile în soluții apoase,
concentrația inițială va fi luată ca concentrație măsurată în soluție la începutul testului. Concentrația va fi determinată după o perioadă de stabilizare, dar înainte de a introduce peștii.
În toate cazurile măsurătorile ce se fac, pe toată durata testului, trebuie să confirme că, la concentrația reală de expunere, pH -ul nu variază cu mai mult de o unitate.
5. Mod de lucru
Metoda test poate fi de 3 tipuri:
* test static - Este testul de toxicitate în care soluția test nu se schimbă (Soluțiile rămân neschimbate pe toata durata testului);
* test semi-static - Este testul de toxicitate, în care soluțiile test sunt înnoite în mod regulat (de ex. la 24 h);
* test cu curgere continuă - Testul de toxicitate în care apa este înnoită permanent în acvariile test.
Reactivi
Soluțiile substanței test:
Soluția stoc - se prepară prin dizolvarea substanței în apa deionizată;
Concentrațiile alese - se prepară din soluția stoc prin diluare; dacă se lucrează cu concentratii mari, substanța poate fi dizolvată direct în apa de diluție.
Pentru obținerea acestor concentrații trebuie să se cunoască gradul de solubilitate. Substanțele trebuie să fie testate până la limita de solubilitate. Pentru unele substanțe, precum substanțele cu solubilitate scăzută sau cele care formează dispersie stabilă, se prepară o concentrație deasupra limitei de solubilitate a substanței pentru a se asigura că se obține acea concentrație maxima solubilă / stabilă, fară ca această, concentrație să perturbe altfel sistemul (ex. filmul de substanță de la suprafața apei împiedică oxigenarea apei). Dispersia ultrasonică poate fi utilizată, în cazul substanțelor cu solubilitate mică în apă, la prepararea soluțiilor stoc.
Când sunt folosite substanțe auxiliare, toate concentrațiile test trebuie să conțină aceiași cantitate de substanță auxiliară. Martorii trebuie expuși la aceiași concentrație de substanțe auxiliare asemănătoare celor utilizate în seriile test. Concentrația substanțelor auxiliare trebuie să fie minimă, fără a depăși 100 mg /l în mediul test.
Testul trebuie realizat fără ajustarea pH -ului. Dacă există o schimbare evidentă a pH-ului este necesar ca testul să se repete cu un pH ajustat, iar rezultatele să fie înregistrate. În acest caz valoarea pH-ului soluției stoc trebuie să se ajusteze la valoarea pH-ului din apa de diluție. Pentru acest scop se prefera HCl și NaOH. Ajustarea pH-ului trebuie să fie făcută astfel încât concentrația substanței test din soluția stoc să nu fie modificată semnificativ. Trebuie, de asemenea, înregistrată orice reacție chimică sau precipitare fizică a compusului test, datorate ajustării pH-ului.
Apa de diluție
Se folosește apa potabilă, necontaminată cu concentrații cu potențial de risc clor, metale grele sau alte substanțe, apa naturală de bună calitate sau apa reconstituită. Apa trebuie să aibă duritatea cuprinsă între 10 și 250 mg /l [CaCO(3)] și pH-ul cuprins între 6,0 și 8,5.
Aparatura
- Toată aparatura să fie din material inert chimic.
- Sistem automatic de diluție
- Dozator de O(2)
- Echipament pentru determinarea durității apei
- Echipament adecvat pentru menținerea temperaturii
- pH- metru
Peștii - test
Peștii trebuie să fie sănătoși, fără malformații, selecționați după criterii de vârstă, posibilitate de întreținere, sensibilitate relativă la substanțele chimice, comoditate pentru testare, factori economici, factori biologici, posibilitatea de comparare a datelor obținute cu cele existente pe plan internațional.
Pregătirea materialului de experimentare
Trebuie ca peștii să provină dintr-un singur stoc, să aibă aproximativ aceiași lungime și vârstă, să fie ținuți cel puțin 12 zile în condițiile următoare:
- de recirculare sau curgere continuă, potrivit sistemului;
- apa;
- lumina - 12 până la 16 ore iluminare zilnică;
- concentrația O(2) dizolvat: cel puțin 80 % saturație;
- hrănire de 3 ori pe săptămână, încetând hrănirea lor cu 24 h înainte de începerea testului.
Mortalitate
În intervalul de 48 h de la introducerea în acvarii de acomodare se înregistrează mortalitățile și se aplică următoarele criterii:
1. mortalități mai mari de 10 % din populație în 7 zile conduce la eliminarea întregului lot;
2. mortalități între 5 și 10 % din populație conduce la continuarea perioadei de acomodare încă 7 zile; dacă nu se mai înregistrează mortalități, lotul este acceptat, altfel este eliminat întregul lot.
3. mortalități mai mici de 5 % din populație conduce la acceptarea întregului lot.
Adaptare
Toți peștii trebuie menținuți în apă de calitate și temperatură constantă timp de 7 zile, înainte de începerea testului.
Procedura test
Se face un test preliminar cu scopul de a obține informații despre șirul de concentrații ce trebuie utilizat în testul principal.
În cazul în care sunt folosite substanțe auxiliare pentru mărirea gradului de solubilitate a substanțelor greu solubile se montează o probă martor (test de control).
În funcție de proprietățile fizico - chimice ale substanței test trebuie selectată cea mai adecvată dintre metodele enunțate mai sus. Peștii sunt expuși la acțiunea substanțelor după cum urmează:
* durata - 96 h;
* număr pești: cel puțin 7 pentru fiecare concentrație;
* acvarii de capacitate convenabilă în relație cu încărcarea cu animale de experimentare;
* încărcare: maxim 1 g /l pentru teste statice și semi-statice, iar pentru cele cu curgere continuă încărcarea poate fi mai mare;
* concentrația test: cel puțin 5 concentrații care diferențiate printr-un factor de maxim 2,2 și pe cât posibil extinse pe domeniul care să acopere de la 0 la 100 % mortalitate;
* apa; vezi pct 7;
* lumina: 12 până la 16 h zilnic;
* temperatura: conform speciei, dar ± 1°C în orice test;
* concentrația O(2) dizolvat: numai puțin de 60 % saturație O(2);
* hrănire: nu,
Peștii sunt urmăriți după primele 2 - 4 ore și cel puțin la intervale de 24 ore. Peștii sunt considerați morți, dacă la atingerea înotătoarei codale nu apare nici o reacție și nu sunt vizibile mișcările respiratorii. Se notează peștii morți și sunt îndepărtați din acvarii. Se notează și anomaliile vizibile - pierderea echilibrului, înotul, funcția respiratorie, pigmentația
Zilnic se măsoară pH, O(2) dizolvat, temperatura.
Test limita
Folosind procedurile descrise, o limită test poate fi stabilită la 100 mg/l pentru a demonstra că CL(50) este mai mare decât această concentrație.
Dacă natura substanței este astfel încât o concentrație 100 mg /l în apa test nu poate fi atinsă, limita test trebuie stabilită la o concentrație egală cu solubilitatea substanței sau maxim de concentrație ce formează o dispersie stabilită în mediul folosit.
Pentru testul limită se folosește același număr de pești - 7-10 pești - ca și pentru testul martor; teoria distribuției binomiale stabilește ca în cazul când se folosesc 10 pești cu zero mortalitate există un grad de încredere de 99,9 % ca CL(50) este mai mare decât concentrația folosită în testul limită. Dacă se folosesc 7-8-9 pești, absența mortalității asigură un grad de încredere de cel puțin 99 % însemnând că CL(50) este mai mare decât concentrația folosită.
Dacă se instalează letalități, trebuie dezvoltat un studiu complex. Dacă sunt observate efecte subletale acestea trebuie notate.
6. Evaluare și raportare
Pentru fiecare perioadă pentru care s-au făcut observații se reprezintă grafic procentul de mortalitate (24, 48, 72 și 96 h ) pentru fiecare perioadă de expunere față de concentrație în scara logaritmică.
Când este posibil și pentru fiecare timp de observație, CL(50) și limitele de confidență (p - 0,05) trebuie estimate prin folosirea procedurilor standard; aceste valori trebuie rotunjite la unitate sau la mai mult de 2 cifre semnificative.
În acele cazuri în care panta curbei concentrație / mortalitate este prea înclinată pentru a permite calculul lui CL(50), o estimare grafică a acestei valori este suficientă.
Când 2 concentrații consecutive într-un raport de 2,2 dau numai 0% și 100 % mortalitate, aceste 2 valori sunt suficiente pentru a indica intervalul în care se situează CL(50).
Dacă s-a observat că stabilitatea și omogenitatea substanței test nu poate fi menținută, aceasta trebuie notată și avută în vedere la interpretarea rezultatelor.
Raportul trebuie să includă următoarele informații:
* informații privitoare la organismele test - nume științific, specie, gen, mărime, numărul folosit pentru fiecare concentrație;
* sursa pentru apa de diluție și caracteristicile chimice principale - pH, duritate, temperatura;
* în cazul substanțelor cu solubilitate scăzută în apa, se trece metoda de preparare a soluției stoc și a soluțiilor test;
* concentrația oricărei substanțe auxiliare;
* lista de concentrații folosite și orice alte informații utilizabile privitoare la stabilitatea concentrațiilor substanțelor chimice testate în soluția test;
* dacă se fac analize chimice sunt date metodele utilizate și rezultatele obținute;
* rezultatul testului limită dacă s-a efectuat;
* motivația alegerii și detaliile procedurii test utilizate (static, semi-static, cu curgere continuă, doza - rata, viteza curgerii, încărcarea cu pești, dacă apa este aerată);
* descrierea echipamentului;
* regimul de iluminare;
* concentrația O(2) dizolvat, valorile pH și temperatura la fiecare 24 h;
* evidența că criteriile de calitate au fost îndeplinite;
* un tabel ce indică mortalitatea cumulativă la fiecare concentrație și la martor (și martor pentru substanța auxiliară folosită, dacă se cere) la fiecare timp de observație recomandat;
* graficul curbei concentrație / procentaj răspuns la sfârșitul testului;
* valorile CL(50) la fiecare timp de observație recomandat (cu 95 % limită de confidență);
* procedurile statistice utilizate pentru determinarea LC(50);
* dacă este folosită o recomandare privitoare la substanță, trebuie menționat rezultatul obținut;
* concentrația cea mai mare a testului, care nu provoacă mortalitate pe toată durata testului;
* cea mai mică concentrație ce provoacă 100% mortalitate pe perioada testului.
D. Metodologia de determinare a toxicității cronice asupra peștilor - metoda de colorare hematoxitina eozină
1. Principiul metodei
Pentru evidențierea efectelor cronice ale substanțelor prioritare/prioritar periculoase s-a ales metoda de colorare hematoxilină - eozină, fiind o metodă accesibilă, permițând decelarea efectelor structurale la nivelul mai multor organe vitale - branhie, intestin subțire, ficat, rinichi, musculatură. Utilizarea acestei metode necesită personal special calificat, deoarece nu este o metodă de rutină.
2. Mod de lucru
Reactivi
alcool etilic absolut
formol
acetonă benzen hematoxilină eozină
albumină
parafină
Aparatura
Microtom;
termostat cu includere în parafină
plita pentru întinderea secțiunilor
microscop
aparat de fotografiat
Sticlărie
vase Borel
lame
lamele
Specia test - Cyprinus carpio L (crap),
Metodologia de intoxicare
Lotul de pești supus experimentării a fost introdus în acvarii cu capacitatea de 30 l; în fiecare acvariu s-au introdus câte 20 de organisme.
Concentrațiile utilizate sunt subletale; alegerea concentrațiilor depinde de caracteristicile substanței investigate.
Testele cronice se desfășoară în regim static.
Metoda de prelevare
Prelevarea peștilor intoxicați pentru investigațiile histopatologice se face la intervale de 30 zile.
Procedura test
Recoltarea peștilor pentru analiza histopatologică se face la 30, 60, 90, 120 și respectiv 150 zile minim până la maxim un an.
Obținerea preparatelor histologice - impune recoltarea fragmentelor de organe și prelucrarea lor după o tehnică de prelucrare histopatologică.
După disecția peștelui se prelevează fragmente de branhii, ficat, intestin subțire, rinichi, musculatură, deoarece sunt organe vitale și totodată organe țintă pentru orice substanță care se acumulează sau are efect toxic.
Fixare
Fragmentele de organe obținute în urma disecției sunt fixate în formol 10 %, pentru oprirea proceselor de degradare ce survin după moarte.
Deshidratare și clarificare
După fixare, piesele sunt deshidratate în baie de alcool etilic, de concentrații crescătoare (70°, 90°, 100°); după deshidratare fragmentele de organe sunt clarificate în acetonă și benzen.
Piesele deshidratate și clarificate sunt incluse în parafină și menținute la temperatură constantă de 57°C.
Blocurile de parafină, ce conțin fragmentele de organe, sunt secționate la microtom; grosimea secțiunilor este cuprinsă între 5 - 6 æ.
Colorare cu hematoxilină eozină
Secțiunile sunt întinse pe lame unse cu albumină Mayer și sunt ținute la termostat cu includere în parafină 5 - 24 h, la o temperatură constantă de 37°C.
Pentru decelarea efectelor produse de substanțele investigate este necesară colorarea secțiunilor și obținerea preparatelor fixe.
În acest sens, lamele cu secțiunile de organe sunt deparafinate în benzen. Apoi sunt trecute prin băi succesive de alcool etilic de concentrații descrescătoare (100°, 90°, 70°), cu scopul de a elimina solventul parafinei, ultima baie fiind cu apă distilată.
Secțiunile sunt colorate cu hematoxilină și eozină. Acești coloranți evidențiază componentele celulare, ca nucleul și citoplasma.
După colorare, secțiunile sunt deshidratate în alcool etilic de concentrații crescătoare (70°, 90°, 100°) și, clarificate în benzen.
Preparatele microscopice sunt montate în balsam de Canada devenind preparate fixe.
3. Examinare și raportare
Se realizează examinarea la microscopul optic și se compara cu martorul.
Modificările celulare se descriu detaliat și se fotografiază.