Normele din 15 septembrie 2005

Anexa -----

la norma sanitară veterinara și pentru siguranța alimentelor
------------------------------------------------------------
CONDIȚII
pentru detectarea microscopica, identificarea sau
estimarea constituentilor de origine animala în furaje
1. Scop și domeniu de aplicare
Aceste condiții trebuie să fie utilizate atunci când detectarea constituentilor de origine animala (definiți ca produse rezultate din prelucrarea carcaselor și a părților acestora provenite de la mamifere, păsări și peste) din furaje este efectuată prin mijloace de examinare microscopica, în cadrul programului de inspecții și controale în domeniul nutritiei animale în conformitate cu
Ordinul ministrului agriculturii, pădurilor, apelor și mediului nr. 717/2003
pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind principiile ce reglementează organizarea inspecțiilor oficiale în domeniul nutritiei animalelor, ce transpune
Directiva Consiliului nr. 95/53/CE
. Poate fi efectuat și un al doilea test, utilizându-se metode diferite sau alternative de analiza pentru detectarea anumitor tipuri de constituenti de origine animala sau pentru stabilirea originii constituentilor de origine animala, cu condiția ca metodele descrise în prezenta anexa să fie utilizate în toate testele oficiale. În plus, poate fi utilizat un protocol diferit atunci când se examinează anumite produse specifice de origine animala, precum plasma sau oasele în seu (a se consulta și pct. 9), cu condiția ca aceste analize să fie efectuate adițional analizelor prevăzute în programul de inspecții și controale.
2. Sensibilitate
În funcție de tipul constituentilor de origine animala, pot fi detectate cantități foarte mici (< 0,1%) de constituenti în furaje.
3. Principiu
O proba reprezentativa, prelevata în conformitate cu
Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 390/2001
pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind controlul oficial al furajelor pentru animale, ce transpune
Directiva Comisiei nr. 76/371/CEE
, va fi supusă identificarii după pregătirea prealabilă. Protocolul descris în continuare este conceput pentru furaje cu conținut redus de umiditate. Furajele cu conținut de umiditate mai mare de 14% trebuie să fie uscate (concentrate) în prealabil.
Materiile prime furajere sau furajele speciale (de exemplu, grăsimi, uleiuri) necesita un tratament special (a se consulta pct. 9). Constituentii de origine animala sunt identificati pe baza caracterelor microscopice tipice (de exemplu, fibre musculare și alte particule de carne, cartilaje, oase, coarne, fire de par, pene, sânge, coji de oua, oase de peste solzi etc.). Identificarea se va face atât din fractia de la sitare (potrivit pct. 6.1), cat și din sedimentul concentrat (potrivit pct. 6.2) al probei.
4. Reactivi
4.1. Agenți de clarificare
4.1.1. Cloralhidrat (soluție apoasa 60% v/v)
4.1.2. Soluție alcalina (NaOH 2,5% sau KOH 2,5% m/v) pentru fractiile de la sitare
4.1.3. Ulei de parafina sau glicerina (viscozitate 68-81) pentru observațiile microscopice în sediment
4.2. Agenți de spalare
4.2.1. Alcool etilic 96%
4.2.2. Acetona
4.3. Agenți de concentrare
4.3.1. Tetracloretan (densitate 1.62)
4.4. Agenți de colorare
4.4.1. Soluție iod/iodura de potasiu (se dizolva 2 g de iodura de potasiu în 100 ml apa și se adauga 1 g de iod sub agitare)
4.4.2. Roșu de alizarina (Alizarin Red) (se dizolva 200 mg roșu de alizarina în 100 ml apa care conține 2,5 ml HCI 1 M)
4.4.3. Reactiv pentru cistina [2 g acetat de plumb și 10 g NaOH/100 ml H(2)O]
4.4.4. Soluție iod/iodura de potasiu în alcool etilic 70%
4.5. Agent de decolorare
4.5.1. Soluție comercială de hipoclorit de sodiu (9,6% clor activ)
5. Echipament și accesorii
5.1. Balanța analitica (d = 0,01 g, cu excepția sedimentului concentrat la care este necesară d = 0,001 g)
5.2. Dispozitive de maruntire, macinare (moara și mojar, în special pentru furaje cu conținut de grasime > de 15%)
5.3. Site cu ochiuri cu diametrul de maximum 0,5 mm
5.4. Palnii de separare sau pahare conice de sedimentare
5.5. Stereomicroscop (cu magnificatie de minimum 40 x)
5.6. Microscop compus (magnificatie minimum 400 x) cu lumina polarizata sau cu lumina de transmisie
5.7. Sticlarie standard de laborator
Tot echipamentul utilizat trebuie să fie foarte curat. Sticlaria și palniile de separare trebuie spalate în masina de spălat sticlaria. Sitele trebuie curatate cu perii aspre.
6. Procedura
Furajele granulate trebuie în prealabil presitate pe baza dimensiunii, dacă ambele fractii sunt examinate ca probe separate.
Se iau cel puțin 50 g de proba și se macina cu grija în moara sau în alt dispozitiv adecvat pentru obținerea particulelor corespunzătoare. Din materialul macinat se iau doua fractii reprezentative, una pentru fractia de sitare de cel puțin 5 g și una de cel puțin 5 g pentru sedimentul concentrat. Colorarea cu agenți de colorare poate fi aplicată adițional pentru identificare.
În scopul identificarii naturii proteinelor animale și a originii particulelor examinate se poate utiliza un sistem de suport al deciziei (de exemplu, Aries) sau probe de referința.
6.1. Identificarea constituentilor de origine animala în fractia de la sitare
O cantitate de minimum 5 g din proba este trecută prin site cu ochiuri cu diametrul de maximum 0,5 mm în cel puțin două fractii.
Fractia/fractiile de sitare cu particule mari, cu dimensiuni mai mari de 0,5 mm (sau o parte reprezentativa din fractie) se întinde în strat subtire pe un suport adecvat și se verifica prezenta componentelor de origine animala la stereomicroscop cu diferite puteri de marire.
Lamele preparate cu fractia/fractiile de sitare cu particule fine, cu dimensiuni mai mari de 0,5 mm, se verifica sistematic la microscopul compus cu obiective diferite pentru a detecta prezenta componentilor de origine animala.
6.2. Identificarea constituentilor de origine animala din sedimentul concentrat
Se iau cel puțin 5 g (cantarite cu precizie de 0,01 g) din proba, se introduc într-un pahar conic sau într-o palnie de separare, adăugându-se cel puțin 50 ml de tetracloretan. După omogenizare se agita conținutul de mai multe ori.
Dacă se utilizează o palnie de separare închisă, amestecul trebuie lăsat pentru sedimentare cel puțin 3 minute. Amestecul este din nou agitat și lăsat pentru sedimentare 3 minute înainte ca sedimentul să fie separat.
Dacă este utilizat un pahar conic de separare, amestecul trebuie lăsat pentru sedimentare cel puțin 5 minute înainte ca sedimentul să fie separat.
Sedimentul separat este uscat la etuva și cantarit repetat până la masa constanta (precizie de 0,001 g). Cantarirea este necesară numai în cazul în care se face o apreciere cantitativă. În cazul în care sedimentul este constituit din fragmente de dimensiuni foarte diferite, acesta poate fi separat prin site cu ochiuri cu diametrul de maximum 0,5 mm în doua fractii.
Sedimentul uscat se examinează în întregime pentru identificarea fragmentelor de oase la stereomicroscop și la microscopul compus.
6.3. Utilizarea agenților de clarificare și de colorare
La identificarea microscopica a constituentilor de origine animala pot fi utilizați agenții speciali de clarificare și colorare:
- cloralhidrat: prin încălzire ușoară, structura celulara poate fi mult mai clara datorită gelatinizarii granulelor de amidon și indepartarii particulelor nedorite;
- soluție alcalina (NaOH 2,5% sau KOH 2,5%): soluțiile alcaline clarifica materialul, pot evidenția fibrele musculare, firele de par sau alte structuri cheratinoase;
- ulei de parafina și glicerina: componentele oaselor pot fi identificate mai bine în acești agenți de clarificare datorită faptului ca majoritatea lacunelor rămân umplute cu aer și apar ca spații negre cu diametrul de aproximativ 5-15 f2æm; - soluția de iod/iodura de potasiu: este utilizata pentru identificarea amidonului (culoare albastra-violeta) și a proteinei (culoare galbena-portocalie). Se dilueaza dacă este necesar;
- soluția de roșu de alizarina: coloreaza oasele, solzii și oasele de peste în roz-roșu. Înainte de uscarea sedimentului (a se consulta pct. 6.2), sedimentul total trebuie transferat într-o eprubeta de sticlă și spălat de doua ori cu câte 5 ml alcool etilic (se utilizează de fiecare data un vortex pentru eprubete, se lasă în repaus timp de un minut și apoi solventul este eliminat). Înaintea utilizării colorantului, sedimentul este decolorat cu cel puțin 1 ml soluție comercială de hipoclorit de sodiu. Pentru reactie se lasă timp de 10 minute. Eprubeta este apoi umpluta cu apa, lăsată în repaus pentru sedimentare timp de 2-3 minute și apoi supernatantul este îndepărtat.
Sedimentul se mai spala de doua ori cu câte 10 ml apa (se utilizează un vortex, se lasă în repaus și apoi apa este eliminata). După îndepărtarea lichidului se adauga 2-10 picaturi (în funcție de volumul sedimentului) de roșu de alizarina. Se amesteca prin agitare și se lasă pentru reactie timp de câteva secunde. Sedimentul este apoi spălat de doua ori cu câte 5 ml alcool etilic și apoi spălat o dată cu acetona (de fiecare data se agita cu vortexul, se lasă în repaus timp de un minut și apoi solventul este eliminat). Sedimentul este apoi uscat;
- reactivul pentru cistina: prin încălzire ușoară, constituentii care conțin cistina (par, pene, fanere etc.) capata o culoare neagra-maronie.
6.4. Examinarea furajelor care pot conține făina de peste
Trebuie examinate la microscopul compus cel puțin câte o lama din fractia fina de pe site și din fractia fina de la sedimentul concentrat (a se consulta pct. 6.1 și 6.2).
În cazul în care eticheta produsului menționează făina de peste ca ingredient sau prezenta acesteia este suspicionata ori detectata la examinarea inițială, trebuie examinate cel puțin două lame suplimentare din fractia fina de pe site, iar sedimentul va fi examinat în întregime.
7. Calcul și evaluare
Procedura descrisă la acest punct trebuie aplicată în cazul controlului oficial în vederea stabilirii concentratiei (nu doar prezenta sau absenta) de constituenti de origine animala din proba.
Calculul poate fi efectuat doar în cazul în care proba conține fragmente de oase.
Fragmentele de oase provenite de la specii terestre homeoterme (de exemplu, mamifere și păsări) pot fi diferențiate de oasele de peste în preparat microscopic, pe baza lacunelor specifice. Proporția de constituenti de origine animala în proba examinata este estimată în funcție de următoarele date:
- proporția estimată (masa %) de fragmente de oase în sedimentul concentrat;
- proporția (masa %) de oase în constituentii de origine animala.
Estimarea se face pe baza a cel puțin 3 lame (dacă este posibil) și cel puțin 5 câmpuri pe lama. În furajele combinate, de regula, sedimentul concentrat nu conține numai fragmente de oase de la animale terestre sau peste, dar și alte componente cu greutate specifică mare, de exemplu, minerale, nisip, fragmente vegetale lignificate etc.
7.1. Estimarea valorii procentuale a fragmentelor de oase
Sxc
Fragmente de oase de la animale terestre % = ───
W
Sxd
Fragmente de oase și solzi de peste % =
───
W
[S = masa sedimentului (mg), c = factorul de corectie (%) pentru estimarea procentului de oase de la animale terestre în sediment, d = factorul de corectie (%) pentru estimarea procentului de oase de peste și solzi în sediment, W = masa probei prelucrate pentru sedimentare (mg)].
7.2. Estimarea valorii constituentilor de origine animala
Proporția de oase în produsele de origine animala este variabila. În cazul fainii de oase procentul este de 50-60%, iar în cazul fainii de carne de 20-30%; la făina de peste procentul de oase și solzi este variabil în funcție de specie, în general de 10-20%.
Dacă se cunoaște tipul de făina de origine animala din proba de analizat, se poate calcula conținutul estimat:
- conținutul estimat de constituenti
Sxc
de la animale terestre (%)
= ─── x 100
Wxf
Sxd
- conținutul estimat de constituenti de peste (%) = ─── x 100
Wxf
[S = masa sedimentului (mg), c = factorul de corectie (%) pentru estimarea procentului de oase de la animale terestre în sediment, d = factorul de corectie (%) pentru estimarea procentului de oase de peste și solzi în sediment, f = factorul de corectie pentru proporția de oase din constituentii de origine animala din proba examinata, W = masa probei prelucrate pentru sedimentare (mg)].
8. Exprimarea rezultatelor examinării
Buletinul de analiza trebuie să conțină informații referitoare la prezenta constituentilor derivati de la animale terestre sau a fainii de peste. Pot exista următoarele situații:
8.1. Referitor la prezenta constituentilor derivati de la animale terestre:
- în proba analizata nu au fost decelati constituenti derivati de la animale terestre la capacitatea de identificare la microscop;
sau
- în proba analizata au fost decelati constituenti derivati de la animale terestre la capacitatea de identificare la microscop.
8.2. Referitor la prezenta fainii de peste:
- în proba analizata nu au fost decelati constituenti derivati din peste la capacitatea de identificare la microscop;
sau
- în proba analizata au fost decelati constituenti derivati din peste la capacitatea de identificare la microscop.
În cazul în care se găsesc constituenti derivati din peste sau de la animale terestre, buletinul cu rezultatul evaluării poate indica suplimentar, dacă este solicitat, estimarea cantitativă a constituentilor detectati (x %, < 0,1%, 0,1-0,5%, 0,5-5% sau > 5%), la care se pot adauga, dacă este posibil, date referitoare la tipul de animal terestru și la constituentii de origine animala identificati (fibre musculare, cartilaje, oase, coarne, par, par de porc, coji de ou, pene, sânge, oase de peste, solzi).
În cazul în care se precizează cantitatea de constituenti, factorul de corectie f utilizat trebuie menționat.
În cazul în care au fost identificate fragmente de oase provenite de la animale terestre, buletinul de analiza va conține o clauza adițională:
"Posibilitatea ca următorii constituenti să fie derivati de la mamifere nu poate fi exclusa."
Aceasta clauza adițională nu este necesară dacă fragmentele de oase de la animale terestre au fost identificate ca aparținând pasarilor sau mamiferelor.
9. Protocol optional pentru analiza grasimilor sau a uleiurilor
Protocolul următor poate fi utilizat pentru analiza grasimilor sau a uleiurilor:
- dacă grasimea este solida, se incalzeste până la lichefiere, de exemplu într-un cuptor cu microunde;
- se transfera 40 ml, cu ajutorul unei pipete, din partea inferioară a grasimii lichefiate într-un tub de centrifuga;
- se centrifugheaza timp de 10 minute la 4.000 rotatii/ minut;
- dacă grasimea se solidifică după centrifugare, se incalzeste tubul din nou până la lichefiere. Se repeta centrifugarea timp de 5 minute la 4.000 rotatii/minut;
- cu ajutorul unei spatule sau a unei lingurite se preleveaza jumătate din sedimentul decantat și se transfera într-o placa Petri sau o lama de microscop pentru identificarea unor posibili constituenti de origine animala (fibre musculare, pene, fragmente de oase). Pentru clarificare sunt recomandate glicerina sau uleiul de parafina;
- sedimentul rămas este utilizat pentru sedimentare, asa cum este descris la pct. 6.2.
---------