Normele din 1 februarie 2007

Anexa 1 la norma sanitară veterinara

I. DETERMINAREA AMIDONULUI

Metoda polarimetrica

1. Scop și domeniu de aplicare

Aceasta metoda se utilizează pentru determinarea nivelurilor de amidon și a produselor de degradare a amidonului cu greutate moleculara mare din furaje, în scopul verificării conformitatii cu Norma veterinara ce stabilește metoda de calcul pentru valoarea energetica a furajelor combinate pentru păsări, aprobată prin Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 17/2004, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 și 1.020 bis din 4 noiembrie 2004, ce transpune în legislația naționala

Directiva Comisiei 86/174/CEE

, și cu Norma sanitară veterinara privind circulația și utilizarea materiilor prime furajere, aprobată prin

Ordinul ministrului agriculturii, pădurilor, apelor și mediului nr. 507/2003 , publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 683 și 683 bis din 29 septembrie 2003, ce transpune în legislația naționala

Directiva Consiliului 96/25/CE

.

2. Principiu

Metoda cuprinde doua etape. în prima etapa, proba se tratează, atunci când este fierbinte, cu acid clorhidric diluat. După clarificare și filtrare, rotatia optica a soluției trebuie masurata prin polarimetrie.

În a doua etapa, proba trebuie extrasa cu etanol 40%. După acidifierea filtratului cu acid clorhidric, clarificand și filtrand soluția, rotatia optica se măsoară ca în prima etapa.

Conținutul în amidon al probei se calculează făcându-se diferența dintre cele doua măsurători, multiplicata cu un factor cunoscut.

3. Reactivi

3.1. Acid clorhidric (w/w) 25%, d: 1,126 g/ml

3.2. Acid clorhidric (w/v) 1,128%

Concentrația trebuie să fie controlată prin titrare, utilizându-se o soluție de hidroxid de sodiu 0,1 mol/litru în prezenta de roșu de metil (w/v) 0,1% în etanol 94% (V/V). 10 ml = 30,94 ml de NaOH 0,1 mol/litru

3.3. Soluție Carrez I: Se dizolva în apa 21,9 g acetat de zinc Zn[CH(3)COO](2). (2)H(2)0 și 3g de acid acetic glacial. Se aduce la volum până la 100 ml cu apa

3.4. Soluție Carrez II: Se dizolva în apa 10,6 g de ferocianura de potasiu [K(4)(Fe(CN)(6)]. 3H(2)0. Se aduce la volum până la 100 ml cu apa

3.5. Etanol 40% (v/v), d: 0,948 g/ml la 20°C.

4. Aparatura

4.1. Retorta Erlenmeyer de 250 ml cu ajustare de sticlă mata standard și cu condensator de reflux

4.2. Polarimetru sau sacharimetru

5. Procedura

5.1. Prepararea probei

Se marunteste proba până când este destul de fina pentru a trece printr-o sita cu ochiuri de 0,5 mm.

5.2. Determinarea rotatiei optice totale (P sau S) (Vezi observatia 7.1)

Se cantaresc 2,5 g din proba maruntita, cu o aproximatie de mg, și se plaseaza într-o retorta gradata de 100 ml. Se adauga 25 ml de acid clorhidric (pct. 3.2), se agita pentru a se obține chiar distribuția probei-test și se adauga încă 25 ml de acid clorhidric (pct. 3.2). Se imerseaza retorta în apa fiarta, agitandu-se energic și constant timp de 3 minute, pentru a se preveni formarea de flocoane. Cantitatea de apa din baia de apa trebuie să fie suficienta pentru ca baia sa rămână la punctul de fierbere, atunci când retorta este introdusă în aceasta.

Retorta nu trebuie să fie scoasa din baie cat timp se agita. După exact 15 minute, se scoate retorta din baie, se adauga 30 ml de apa rece și se raceste imediat la 20°C.

Se adauga 5 ml de soluție Carrez I (pct. 3.3) și se agita timp de un minut. Apoi se adauga 5 ml de soluție Carrez II (pct. 3.4) și se agita din nou, timp de un minut. Se aduce la volum cu apa, se omogenizeaza și se filtreaza. Dacă filtratul nu este perfect clar (fapt ce este rar), se repeta determinarea utilizându-se o cantitate mai mare de soluții Carrez I și II, de exemplu 10 ml.

Se măsoară rotatia optica a soluției într-un tub de 200 mm cu polarimetru sau cu sacharimetru.

5.3. Determinarea rotatiei optice (P' sau S') a substanțelor solubile în etanol 40%

Se cantaresc 5 g din proba cu o aproximatie de mg, se plaseaza într-o retorta gradata de 100 ml și se adauga aproximativ 80 ml de etanol (pct. 3.5) (vezi observatia 7.2). Se lasă retorta sa stea timp de o ora la temperatura camerei. În acest timp, se agita puternic de 6 ori, astfel încât proba-test este bine amestecata cu etanol. Se aduce la volum cu etanol (pct. 3.5), se omogenizeaza și se filtreaza.

Se picura 50 ml din filtrat (= 2,5 g din proba) într-o retorta Erlenmeyer de 250 ml, se adauga 2,1 ml de acid clorhidric (pct. 3.1) și se agita cu vigoare. Se echipeaza retorta Erlenmeyer cu un condensator de reflux și se imerseaza acesta din urma într-o baie de apa fierbinte. După exact 15 minute se indeparteaza retorta Erlenmeyer din baie, se transfera conținutul într-o retorta gradata de 100 ml, clatindu-se cu putina apa rece, și se raceste la 20°C. Se clarifica filtratul utilizându-se soluțiile Carrez I (pct. 3.3) și II (pct. 3.4), se aduce la volum cu apa, se omogenizeaza, se filtreaza și se măsoară rotatia optica, asa cum s-a indicat la pct. 5.2.

6. Calcularea rezultatelor

Conținutul de amidon (%) este calculat după cum urmează:

6.1. Măsurare cu polarimetru

2000(P - P')

Conținut de amidon (%) = -------------- ,

20°

[f2α]

D

unde:

P = rotatia optica totală în grade;

P'= rotatia optica în grade a substanțelor solubile în etanol 40%'(V/V);

20°

[f2α]

= rotație optica specifică de amidon pur. Valorile numerice

D

acceptate convențional pentru acest factor sunt următoarele:

+ 185,9°: amidon din orez;

+ 185,4°: amidon din cartofi;

+ 184,6°: amidon din porumb;

+ 182,7°: amidon din grâu;

+ 181,5°: amidon din orz;

+ 181,3°: amidon din ovaz;

+ 184,0°: alte tipuri de amidon și amestecuri de amidon din furaje combinate.

6.2. Măsurarea cu zaharimetru

2000

(2N x 0,665)x(S-S')

26,6 N x (S-S')

Conținut de amidon = ------- x ------------------- - ----------------,

20°

20°

[f2α]

100

[α]

D

D

unde:

S = rotatia optica totală în grade zaharimetrice;

S' = rotatia optica în grade zaharimetrice a substanțelor solubile în etanol 40% (V/V);

N = greutatea în grame a sucrozei în 100 ml de apa, ce da o rotație optica de 100 grade zaharimetrice, atunci când este masurata utilizând un tub de 200 mm. Greutatea variaza după cum urmează, în conformitate cu tipul de zaharimetru utilizat:

- 16,29 g pentru zaharimetrele franceze;

- 26,00 g pentru zaharimetrele germane;

- 20,00 g pentru zaharimetrele mixte;

20°

[f2α]

= rotație optica specifică a amidonului pur (vezi pct 6.1).

D

6.3. Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a doua determinări paralele efectuate pe aceeași proba trebuie să fie de maximum 0,4, în valoare absolută, pentru un conținut de amidon mai mic de 40% și 1,1%, în valoare relativă, pentru continuturi de amidon de minimum 40%.

7. Observații

7.1. Dacă proba conține mai mult de 6% carbonati, calculati în termeni de carbonat de calciu, aceștia trebuie să fie distrusi prin tratament cu exact cantitatea corespunzătoare de dilutie de acid sulfuric, înainte de determinarea rotatiei optice totale.

7.2. În cazul produselor cu un conținut ridicat de lactoza, precum zerul pudra sau laptele praf degresat, se procedează după cum urmează: după ce se adauga 80 ml de etanol (pct. 3.5), se echipeaza retorta cu un condensator de reflux și se imerseaza aceasta din urma într-o baie cu apa la 50°C, timp de 30 de minute. Se lasă să se raceasca și se continua analiza asa cum s-a indicat la pct. 5.3.

7.3. În cazul în care următoarele materii furajere sunt prezente în cantitate semnificativă în furaje, pot aparea interferente atunci când se determina conținutul de amidon prin metoda polarimetrica și, de aceea, pot fi obținute rezultate incorecte:

a) produse din sfecla (de zahăr), cum ar fi: pulpa de sfecla (de zahăr), melasa de sfecla (de zahăr), pulpa melasata de sfecla (de zahăr), borhot de sfecla (de zahăr), zahăr (de sfecla);

b) pulpa de citrice;

c) samanta de în; turte de în obținute prin presare; turte de în rezultate după extracție;

d) samanta de rapita; turte de rapita obținute prin presare; turte de rapita rezultate după extracție; hoaspe de samanta de rapita;

e) samanta de floarea-soarelui; turte de floarea-soarelui rezultate după extracție; samanta de floarea-soarelui parțial decorticata, extrasa;

f) turte de copra obținute prin presare; turte de copra rezultate după extracție;

g) pulpa de cartof;

h) drojdie deshidratata;

i) produse bogate în inulina (de exemplu, taitei și făina de topinambur);

j) jumari.

II. DETERMINAREA PROTEINEI BRUTE

1. Scop și domeniu de aplicare

Aceasta metoda se utilizează pentru determinarea conținutului de proteina bruta din furaje pe baza conținutului de azot, determinat în conformitate cu metoda Kjeldahl.

2. Principiu

Proba se digera cu acid sulfuric în prezenta unui catalizator. Soluția acida trebuie alcalinizata cu soluție de hidroxid de sodiu. Amoniacul se distileaza și se colectează într-o cantitate masurata de acid sulfuric, al cărui exces este titrat cu o soluție standard de hidroxid de sodiu.

3. Reactivi

3.1. Sulfat de potasiu

3.2. Catalizator: oxid de cupru (II) CuO sau sulfat de cupru pentahidrat (II), CuS0(4) . 5H(2)0

3.3. Zinc granulat

3.4. Acid sulfuric, p20 = 1,84 g/ml

3.5. Acid sulfuric C[1/2 H(2)S0(4)] = 0,5 mol/l

3.6. Acid sulfuric C[1/2 H(2)S0(4)] = 0,1 mol/l

3.7. Indicator roșu de metil: se dizolva 300 mg de roșu de metil în 100 ml de etanol, f2'f3 = 95-96% (v/v)

3.8. Soluție de hidroxid de sodiu (poate fi utilizat gradul tehnic) f2â = 40 g/100 ml (m/v: 40%)

3.9. Soluție c de hidroxid de sodiu = 0,25 ml/l

3.10. Soluție c de hidroxid de sodiu = 0,1 mol/l

3.11. Piatra ponce granulata, spalata în acid clorhidric și aprinsa

3.12. Acetanilida ( m². = 114°C, N = 10,36%)

3.13. Sucroza (libera de azot).

4. Aparatura

Aparatura potrivita pentru efectuarea digestiei, distilarii și titrarii, în conformitate cu procedura Kjedahl.

5. Procedura

5.1. Digestie

Se cantareste 1 g de proba cu o aproximatie de 0,001 g și se transfera în retorta aparatului de digestie. Se adauga 15 g de sulfat de potasiu (pct. 3.1), o cantitate corespunzătoare de catalizator (pct. 3.2) [0,3 până la 0,4 g de oxid de cupru (II) sau 0,9 până la 1,2 g de sulfat de cupru pentahidrat(II)], 25 ml de acid sulfuric (pct. 3.4) și câteva granule de piatra ponce (pct. 3.11) și se amesteca. Se incalzeste mai întâi retorta cu moderatie, rotindu-se din când în când, dacă este necesar, până când masa de proba s~a carbonizat și spuma a dispărut. Se incalzeste apoi mai intens până când lichidul fierbe constant, încălzirea este adecvată dacă acidul fiert condenseaza pe peretele retortei. Se previne ca pereții sa devină supraincalziti și ca particule organice să se lipeasca pe aceștia. Când soluția devine clara și verde deschis, se continua să se fiarba timp de încă doua ore, apoi se lasă să se raceasca.

5.2. Distilare

Se adauga cu grija destula apa pentru dizolvarea completa a sulfatilor. Se lasă să se raceasca și apoi se adauga câteva granule de zinc (pct. 3.3).

Se plaseaza în retorta de colectare a aparatului de distilare o cantitate exactă masurata de 25 ml de acid sulfuric (pct. 3.5 sau 3.6), depinzand de conținutul de azot estimat. Se adauga câteva picaturi de indicator de roșu de metil (pct. 3.7).

Se conecteaza retorta de digestie la condensatorul aparatului de distilare și se imerseaza porțiunea terminala a condensatorului în lichidul conținut în retorta de colectare, la o adancime de cel puțin 1 cm (vezi observatia de la pct. 8.3). Se toarna incet 100 ml de soluție de hidroxid de sodiu (pct. 3.8) în retorta de digestie, fără a se pierde amoniac (vezi observatia de la pct. 8.1).

Se incalzeste retorta până când amoniacul s-a distilat.

5.3. Titrare

Se titreaza excesul de acid sulfuric în retorta de colectare cu soluție de hidroxid de sodiu (pct. 3.9 sau 3.10), depinzand de concentrația de acid sulfuric utilizata, până când este atins punctul final.

5.4. Test martor

Pentru a se confirma ca reactivii sunt liberi de azot, se efectuează un test martor (digestie, distilare și titrare), utilizându-se 1 g de sucroza (pct. 3.13) în locul probei.

6. Calcularea rezultatelor

Conținutul în proteina bruta este calculat în conformitate cu următoarea formula:

[V(0) - V(1)] x c x 0,014 x 100 x 6,25 ,

--------------------------------------

m

unde:

V(0) = volumul (ml) de NaOH (pct. 3.9 sau pct. 3.10) utilizat la testul martor;

V(1) = volumul (ml) de NaOH (pct. 3.9 sau pct. 3.10) utilizat la titrarea probei;

c = concentrația (mol/l) de hidroxid de sodiu (pct. 3.9 sau pct. 3.10);

m = masa probei (g).

7. Verificarea metodei

7.1. Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a doua determinări paralele, efectuate pe aceeași proba, trebuie să fie de maximum:

- 0,2% în valoare absolută, pentru un conținut de proteina bruta mai mic de 20%;

- 1,0% relativ la valoarea mai mare, pentru un conținut de proteina bruta de la 20% la 40%;

- 0,4% în valoare absolută, pentru un conținut de proteina bruta de peste 40%.

7.2. Acuratete

Se efectuează analiza (digestie, distilare și titrare) pe 1,5 până la 2 g de acetanilida (pct. 3.12), în prezenta a 1 g de sucroza (pct. 3.13); 1 g de acetanilida consuma 14,8 ml de acid sulfuric (pct. 3.5). Recuperarea trebuie să fie de cel puțin 99%.

8. Observații

8.1. Aparatura poate fi de tip manual, semiautomat sau automat. Dacă aparatura necesita transferul între fazele de digestie și de distilare, acest transfer trebuie să fie efectuat fără pierdere. Dacă retorta aparatului de distilat nu este echipata cu o palnie, se adauga imediat, înainte de conectarea retortei la condensator, hidroxid de sodiu, turnand incet pe pereți.

8.2. Dacă materialul digerat se solidifică, se reîncepe determinarea, utilizându-se o cantitate mai mare de acid sulfuric (pct. 3.4) decât cea specificată anterior.

8.3. Pentru produse cu un conținut scăzut de azot, volumul de acid sulfuric (pct. 3.6) ce trebuie plasat în retorta de colectare poate fi redus până la 10 sau 15 ml, dacă este necesar, și se aduce la volum cu apa până la 25 ml.

III. DETERMINAREA PROTEINEI BRUTE DESCOMPUSE DE PEPSINA ȘI ACID CLORHIDRIC

1. Scop și domeniu de aplicare

Aceasta metoda se utilizează pentru determinarea fracțiunii de proteina bruta descompusa de pepsina și acid clorhidric în baza condițiilor definite. Aceasta este aplicabilă tuturor furajelor.

2. Principiu

Proba trebuie incalzita timp de 48 de ore, la 40°C, într-o soluție clorhidrica de pepsina. Suspensia trebuie filtrata, iar conținutul în azot al filtratului, determinat în conformitate cu metoda pentru determinarea proteinei brute.

3. Reactivi

3.1. Acid clorhidric, d: 1,125

3.2. Acid clorhidric, 0,075 N

3.3. 2,0 U/mg pepsina. Activitatea pepsinei este definită de metoda descrisă în partea a 4-a a acestei anexe și trebuie să fie stabilită în conformitate cu acea metoda.

3.4. Aproximativ 0,2% (w/v) soluție proaspăt preparata de acid clorhidric (pct. 3.2); Activitate: 400 U/L

3.5. Emulsie antispuma (de exemplu, silicon).

3.6. Toți reactivii menționați la pct. 3 pentru metoda de determinare a proteinei brute.

4. Aparatura

4.1. Baie de apa sau incubator, fixat la 40°C ± 1°C

4.2. Aparatura de digestie și de distilare Kjedahl.

5. Procedura

5.1. Prepararea soluției (vezi observatia 7.2)

Se cantaresc 2 g din proba, cu o aproximatie de mg, și se plaseaza într-o retorta gradata de 500 ml. Se adauga 450 ml de soluție clorhidrica de pepsina (pct. 3.4), incalzita anterior la 40°C, și se agita pentru a se preveni formarea flocoanelor. Se controlează ca ph-ul suspensiei să fie mai mic de 1,7. Se plaseaza retorta într-o baie de apa sau incubator (pct. 4.1) și se lasă acolo timp de 48 de ore. Se agita după 8, 24 și 32 de ore. După 48 de ore se adauga 15 ml de acid clorhidric (pct. 3.1), se raceste până la 20°C, se aduce la volum cu apa și se filtreaza.

5.2. Digestia

Se iau 250 ml de filtrat și se plaseaza în retorta aparatului de distilare (pct. 4.2). Se adauga reactivii necesari pentru digestia indicată în a doua propozitie a pct. 5.1 din metoda pentru determinarea proteinei brute. Se omogenizeaza și se aduce la fierbere. Dacă se formează orice spuma, se adauga câteva picaturi de emulsie antispuma (pct. 3.5). Se continua fierberea cu vigoare până când apa s-a evaporat aproape complet. Se reduce căldură și se elimina cu atenție ultimele urme de apa.

Când soluția devine clara și incolora (sau verde deschis, dacă este utilizat un catalizator pe bază de cupru), se continua fierberea timp de încă o ora. Se lasă să se raceasca.

5.3. Distilare și titrare

Se procedează, asa cum s-a indicat la pct. 5.2 și 5.3 din metoda pentru determinarea proteinei brute.

5.4. Test martor

Se efectuează un test martor, aplicându-se aceeași procedura, dar omitandu-se proba ce trebuie analizata.

6. Calcularea rezultatelor

Se scade volumul de acid sulfuric consumat la testul martor din cel consumat la proba-test. 1 ml de acid sulfuric 0,1 N corespunde la 1,4 mg de azot.

Se multiplica cantitatea de azot cu factorul 6,25. Se exprima rezultatul ca procent din proba.

Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a doua determinări paralele, efectuate pe aceeași proba, trebuie să fie de maximum:

- 0,4, în valoare absolută, pentru un conținut mai mic de 20%;

- 2,0%, în valoare absolută, pentru un conținut peste 20% și nu mai mult de 40%;

- 0,8, în valoare absolută, pentru un conținut de peste 40%.

7. Observații

7.1. Valorile obținute prin aceasta metoda nu au conexiune directa cu digestibilitatea în vivo.

7.2. Produsele cu un conținut în ulei sau grasime ce depășește 10% trebuie mai întâi să fie degresate prin extracție cu eter petrol (B.P. 40°C până la 60°C).

IV. ESTIMAREA ACTIVITĂȚII PEPSINEI

1. Scop și domeniu de aplicare

Aceasta metoda se utilizează la stabilirea activității de pepsina utilizata în determinarea proteinei brute descompuse de pepsina și acid clorhidric.

2. Principiu

Hemoglobina trebuie tratata cu pepsina, într-un mediu de acid clorhidric, în baza condițiilor definite. Fracțiunea nehidrolizata a proteinei este precipitata în acid tricloracetic. Sunt adăugate filtratului hidroxid de sodiu și reactiv Folin-Ciocalteu. Densitatea optica a acestei soluții trebuie masurata la lungimea de unda de 750 nm, iar cantitatea corespunzătoare de tirozina trebuie citită de pe curba de calibrare.

Definiție: Unitatea de pepsina este definită ca fiind cantitatea din acea enzima ce, în baza condițiilor metodei, eliberează pe minut o anumită cantitate din grupele hidroxiaril care, atunci când intră în contact cu reactivul Folin-Ciocalteu, are o densitate optica corespunzătoare celei la care un f2æmol de tirozina reactioneaza în aceeași maniera.

3. Reactivi

3.1. Acid clorhidric 0,2 N

3.2. Acid clorhidric 0,06 N

3.3. Acid clorhidric 0,025 N

3.4. Soluție 5% (w/v) de acid tricloracetic

3.5. Soluție de hidroxid de sodiu 0,5 N

3.6. Reactiv Folin-Ciocalteu.

Se plaseaza 100 g de tungstat de sodiu (Na(2)WO(4). 2H(2)O), 25 g de molibdat de sodiu (Na(2)MoO(4). 2H(2)O) și 700 ml de apa într-o retorta cu fundul rotund de 2 litri echipata cu o imbinare standard de sticlă mata. Se adauga 50 ml de acid fosforic (d:1,71) și 100 ml de acid clorhidric concentrat (d: 1,19), se conecteaza un condensator de reflux la retorta, se aduce la fierbere și se tine soluția fierband ușor timp de 10 ore. Se lasă să se raceasca, se detaseaza condensatorul de reflux, se adauga 175 g de sulfat de litiu (Li(2)SO(4). 2H(2)O), 50 ml de apa și 1 ml de bromura. Se fierbe timp de 15 minute pentru a se elimina excesul de bromura.

Se lasă să se raceasca, se transfera soluția într-o retorta gradata de un litru, se aduce la volum cu apa, se omogenizeaza și se filtreaza. Nu trebuie să rămână nicio coloratie verzuie. Înainte de utilizare se dilueaza un volum de reactiv cu doua volume de apa.

3.7. Soluție de hemoglobina

Se cantareste o cantitate de hemoglobina (aproximativ 2 g de substrat proteic determinat în conformitate cu Anson) ce corespunde la 354 mg de azot *1) și se plaseaza într-o retorta de 200 ml echipata cu o imbinare standard de sticlă mata.

--------

*1) Se determina conținutul în azot prin metoda semi-micro Kjeldahl (conținutul teoretic: 17,7% de azot).

Se adauga cativa ml de acid clorhidric (pct. 3.2), se conecteaza retorta la pompa de vacuum și se agita până când hemoglobina a fost dizolvată complet. Se eliberează vacuumul și se adauga, în timp ce se agita, acid clorhidric (pct. 3.2), se completează până la 100 ml. Se prepara imediat înainte de utilizare.

3.8. Soluție standard de tirozina

Se dizolva 181,2 mg de tirozina în acid clorhidric (pct. 3.1) și se completează până la un litru cu același acid (soluție Stick). Se iau 20 ml și se dilueaza până la 100 ml cu acid clorhidric (pct. 3.1). 1 ml din aceasta soluție conține 0,2 f2æmoli de tirozina.

4. Aparatura

4.1. Baie de apa fixată la 25°C ± 0,1°C prin ultratermostat

4.2. Spectrofotometru

4.3. Cronometru, acuratete: o secunda

4.4. Ph-metru.

5. Procedura

5.1. Prepararea soluției (vezi observatia de la pct. 7.1)

Se dizolva 150 mg de pepsina în 100 ml de acid clorhidric (pct. 3.2). Se pipeteaza 2 ml din soluție într-o retorta gradata de 50 ml și se aduce la volum cu acid clorhidric (pct. 3.3). Ph-ul, controlat cu ph-metru, trebuie să fie de 1,6 ± 0,1. Se imerseaza retorta într-o baie de apa (pct. 4.1).

5.2. Hidroliza

Se pipeteaza 5,0 ml de soluție de hemoglobina (pct. 3.7) într-o eprubeta, se incalzeste într-o baie de apa la 25°C (pct. 4.1), se adauga 1 ml de soluție de pepsina obținută ca la pct. 5.1 și se amesteca cu o bagheta de sticlă ingrosata la un capăt, cu aproximativ 10 miscari înainte și înapoi. Se lasă eprubeta într-o baie de apa la 25°C, exact 10 minute, măsurate de la adăugarea soluției de pepsina (trebuie să fie respectate cu strictețe durata și temperatura). Apoi se adauga 10,0 ml de soluție de acid tricloracetic (pct. 3.4), incalzita anterior la 25°C, se omogenizeaza și se filtreaza printr-un filtru uscat.

5.3. Evoluția colorarii și măsurarea densitatii optice

Se pipeteaza 5,0 ml de filtrat într-o retorta Erlenmeyer de 50 ml, se adauga 10,0 ml de soluție de hidroxid de sodiu (pct. 3.5) și, agitandu-se constant, 3 ml de reactiv Folin-Ciocalteu diluat (pct. 3.6). După 5 până la 10 minute, se determina densitatea optica a soluției cu spectro-fotometru la 750 nm în celule de 1 cm impermeabile.

5.4. Test martor

Pentru fiecare determinare se efectuează un test martor, după cum urmează: Se pipeteaza 5 ml de soluție de hemoglobina (pct. 3.7) într-o eprubeta, se incalzeste într-o baie de apa la 25°C (pct. 4.1), se adauga 10,0 ml de soluție de acid tricloracetic (pct. 3.4) incalzita anterior la 25°C, se omogenizeaza, apoi se adauga 1,0 ml de soluție de pepsina obținută la pct. 5.1. Se amesteca cu o bagheta de sticlă și se lasă eprubeta în baia de apa (pct. 4.1) la 25°C pentru exact 10 minute. Se omogenizeaza și se filtreaza printr-un filtru uscat. Se urmează procedura indicată la pct. 5.3.

5.5. Curba de calibrare

Se plaseaza 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 și 5,0 ml alicote de soluție standard de tirozina (pct. 3.8), corespunzând la 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 și 1,0 f2æmoli de tirozina respectiv, în retorte Erlenmeyer de 50 ml. Se încheie seriile cu o soluție de referința libera de tirozina. Se aduce la volum până la 5 ml cu acid clorhidric (pct. 3.1). Se adauga 10,0 ml de soluție de hidroxid de sodiu (pct. 3.5) și, agitandu-se constant, 3 ml de dilutie de reactiv Folin-Ciocalteu (pct. 3.6). Se măsoară densitatea optica, asa cum s-a indicat la ultima propozitie a pct. 5.3. Se traseaza curba de calibrare prin schitarea densitatilor optice corelate cu cantitățile de tirozina.

6. Calcularea rezultatelor

De pe curba de calibrare se citește cantitatea de tirozina în f2æmoli ce corespunde densitatii optice a soluției colorate, corectată pe baza valorii martor.

Activitatea pepsinei, în f2æmoli de tirozina la 25°C per mg și per minut, se calculează utilizându-se formula:

0,32a

Unități per mg (U/mg) = --------- ,

P

unde:

a = cantitatea de tirozina în f2æmoli ce se citește de pe curba de calibrare;

P = greutatea în mg a cantității de pepsina adăugată la pct. 5.2.

7. Observații

7.1. Cantitatea de pepsina ce trebuie dizolvată trebuie să fie astfel încât, la măsurarea fotometrica finala, să fie obținută o densitate optica de 0,35 ± 0,035.

7.2. Doua unități per mg, obținute prin aceasta metoda, corespund la: 3,64 miliunitati Anson/mg (f2æmoli de tirozina/mg . min. la 35,5°C) sau 36.400 unități comerciale/g (f2æmoli de tirozina/g în 10 min. la 35,5°C).

V. DETERMINAREA DE GOSIPOL LIBER

1. Scop și domeniu de aplicare

Aceasta metoda se utilizează pentru determinarea nivelurilor de gosipol liber, de gosipol total și de substanțe chimic legate de acesta din samanta de bumbac, făina de samanta de bumbac și brichete de samanta de bumbac și din furaje combinate ce conțin aceste substanțe, atunci când sunt prezente în cantitate mai mare de 20 ppm.

2. Principiu

Gosipolul trebuie extras în prezenta 3-aminopropan-1-ol, fie cu un amestec de propan-2-ol și hexan, pentru determinarea gosipolului liber, sau cu dimetilformamida, pentru determinarea gosipolului total. Gosipolul este convertit de anilina în gosipol-dianilina, a carei densitate optica este masurata la lungimea de unda de 440 nm.

3. Reactivi

3.1. Amestec de propan-2-olhexan: se amesteca 60 de părți de volum de propan-2-ol A.R. cu 40 de părți de volum de n-hexan.

3.2. Solvent A: se plaseaza într-o retorta gradata de 1 litru aproximativ 500 ml de amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1), 2 ml de aminopropan-1-ol, 8 ml de acid acetic glacial și 50 ml de apa. Se aduce la volum cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1). Acest reactiv este stabil timp de o săptămâna.

3.3. Solvent B: se pipeteaza 2 ml de 3-aminopropan-1-ol și 10 ml de acid acetic glacial într-o retorta gradata de 100 ml. Se raceste la temperatura camerei și se aduce la volum cu N, N-dimetilformamida. Acest reactiv este stabil timp de o săptămâna.

3.4. Anilina A.R.: Dacă densitatea optica a testului martor depășește 0,022, se distileaza anilina peste praf de zinc, aruncand prima și ultima fracțiune de 10% a distilatului. Refrigerat și depozitat într-o retorta maro cu dop de sticlă, acest reactiv se va tine timp de câteva luni.

3.5. Soluție standard A de gosipol: Se plaseaza 27,9 mg de acetat de gosipol într-o retorta gradata de 250 ml. Se dizolva și se aduce la volum cu solvent A (pct. 3.2). Se pipeteaza 50 ml din aceasta soluție într-o retorta gradata de 250 ml și se aduce la volum cu solvent A. Concentrația în gosipol a acestei soluții este de 0,02 mg per ml. Se lasă sa stea timp de o ora la temperatura camerei înainte de utilizare.

3.6. Soluție B standard de gosipol: Se plaseaza 27,9 mg de acetat de gosipol într-o retorta gradata de 50 ml. Se dizolva și se aduce la volum cu solvent B (pct. 3.3). Concentrația de gosipol a acestei soluții este de 0,5 mg per ml.

Soluțiile standard A și B de gosipol vor rămâne stabile timp de 24 de ore, dacă au fost ferite de lumina.

4. Aparatura

4.1. Mixer (cu pahar): aproximativ 35 rpm.

4.2. Spectrofotometru.

5. Procedura

5.1. Proba-test

Cantitatea de proba-test utilizata depinde de conținutul estimat de gosipol al probei. Este preferabil să se lucreze cu o proba-test mica și cu o parte relativ mare de alicota a filtratului, astfel încât să se obțină suficient gosipol, pentru ca să fie posibila măsurarea fotometrica precisa. Pentru determinarea de gosipol liber din samanta de bumbac, făina de samanta de bumbac și din brichetele de samanta de bumbac, proba-test nu trebuie să depășească 1 g. Pentru furaje combinate, aceasta poate fi de maximum 5 g. O parte de alicota de 10 ml din filtrat este corespunzătoare în majoritatea cazurilor. Aceasta trebuie să conțină 50 până la 100 f2æg de gosipol. Pentru determinarea gosipolului total, proba-test trebuie să fie între 0,5 și 5 g, pentru ca o parte de 2 ml de alicota din filtrat sa conțină 40 până la 200 f2æg de gosipol.

Analiza trebuie să fie efectuată la o temperatura a camerei de aproximativ 20°C.

5.2. Determinarea de gosipol liber

Se plaseaza proba-test într-o retorta cu gat stramt de 250 ml, fundul retortei fiind acoperit cu sticlă pisata. Utilizându-se o pipeta, se adauga 50 ml de solvent A (pct. 3.2), se astupa retorta și se amesteca timp de o ora cu mixerul. Se filtreaza printr-un filtru uscat și se colectează filtratul într-o retorta cu gatul stramt. Se acoperă palnia în timpul filtrarii cu o sticlă de ceas. Se pipeteaza părți identice de alicota din filtrat ce conține 50 până la 100 f2æg de gosipol în fiecare din cele doua retorte gradate de 25 ml (A și B). Dacă este necesar, se aduce la volum până la 10 ml cu solventul A (pct. 3.2). Apoi se aduce la volum conținutul retortei (A) cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1). Aceasta soluție este utilizata ca soluție de referința față de care se măsoară soluția probei.

Se pipeteaza 10 ml de solvent A (pct. 3.2) în fiecare dintre celelalte doua retorte gradate de 25 ml (C și D). Se aduce la volum conținutul retortei (C) cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1). Aceasta soluție este utilizata ca soluție de referința față de care se măsoară soluția testului martor.

Se adauga 2 ml de anilina (pct. 3.4) în fiecare dintre retorte (D) și (B). Se incalzeste timp de 30 de minute deasupra unei băi de apa fierbinte, pentru a dezvolta culoarea. Se raceste la temperatura camerei, se aduce la volum cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1), se omogenizeaza și se lasă sa stea timp de o ora.

Se determina densitatea optica a soluției testului martor (D) prin comparare cu soluția de referința (C) și densitatea optica a soluției probei (B) prin comparare cu soluția de referința (A), cu spectrofotometru la o lungime de unda de 440 nm, utilizându-se celule de sticlă de 1 cm.

Se scade densitatea optica a soluției testului martor din cea a soluției probei (= densitatea optica corectată). Din aceasta valoare se calculează conținutul în gosipol liber, asa cum s-a indicat la pct. 6.

5.3. Determinarea gosipolului total

Se plaseaza o proba-test ce conține 1 până la 5 mg de gosipol într-o retorta gradata de 50 ml și se adauga 10 ml de solvent B (pct. 3.3). În același timp, se prepara un test martor, plasand 10 ml de solvent B (pct. 3.3) în alta retorta gradata de 50 ml. Se incalzesc cele doua retorte timp de 30 de minute deasupra unei băi de apa fierbinte. Se raceste la temperatura camerei și se aduce la volum conținutul fiecărei retorte cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1), se omogenizeaza și se lasă sa sedimenteze timp de 10 până la 15 minute, apoi se filtreaza și se colectează filtratele în retorte de sticlă mata cu gat stramt.

Se pipeteaza 2 ml de filtrat al probei în fiecare dintre cele doua retorte gradate de 25 ml și încă 2 ml de filtrat al probei martor în fiecare dintre alte doua retorte de 25 ml. Se aduce la volum conținutul unei retorte din fiecare serie până la 25 ml, cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1). Aceste soluții sunt utilizate ca soluții de referința.

Se adauga 2 ml de anilina (pct. 3.4) în fiecare dintre cele doua retorte. Se incalzeste timp de 30 de minute deasupra unei băi de apa fierbinte, pentru a dezvolta culoarea. Se raceste la temperatura camerei, se aduce la volumul de 25ml cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1), se omogenizeaza și se lasă sa sedimenteze timp de o ora.

Se determina densitatea optica, asa cum s-a indicat la pct. 5.2 pentru gosipolul liber. Din aceasta valoare se calculează conținutul de gosipol liber, asa cum s-a indicat la pct. 6.

6. Calcularea rezultatelor

Rezultatele pot fi calculate fie pornindu-se de la densitatea optica specifică (pct. 6.1), fie prin referire la o curba de calibrare (pct. 6.2).

6.1. Utilizarea densitatii optice specifice

Densitatile optice specifice, în baza condițiilor descrise, sunt următoarele:

1%

gosipol liber: E ----- = 625

1 cm

1%

gosipol total: E ----- = 600

1 cm

Conținutul de gosipol liber și total al probei este calculat după următoarea formula:

E x 1250

% gosipol = ---------------- ,

1%

E(1 cm) x p x a

unde:

E = densitatea optica corectată, determinata asa cum s-a indicat la pct. 5.2;

p = proba-test, în g;

a = parte de alicota a filtratului, în ml;

6.2. Utilizarea curbei de calibrare

6.2.1. Gosipol liber

Se prepara doua serii de cinci retorte gradate de 25 ml.

Se pipeteaza alicote de 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 și 10,0 de soluție standard A de gosipol (pct. 3.5) în fiecare serie de retorte. Se aduce la volum până la 10 ml cu solvent A (pct. 3.2). Se completează fiecare serie cu o retorta gradata de 25 ml care conține numai 10 ml de solvent A (pct. 3.2) (test martor).

Se aduc la volum retortele din primele serii (incluzând retorta pentru testul martor) până la 25 ml cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1) (serii de referința).

Se adauga 2 ml de anilina (pct. 3.4) pentru fiecare retorta din a doua serie (incluzând retorta pentru testul blanc). Se incalzeste timp de 30 de minute într-o baie de apa fierbinte pentru a dezvolta culoarea. Se raceste la temperatura camerei, se aduce la volum cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1), se omogenizeaza și se lasă sa stea timp de o ora (serii standard).

Densitatea optica a soluțiilor din seriile standard se determina, asa cum s-a indicat la pct. 5.2, prin comparare cu soluțiile corespunzătoare din seriile de referința. Se traseaza curba de calibrare prin schitarea densitatii optice în raport cu cantitățile de gosipol (în f2æg).

6.2.2. Gosipol total

Se prepara 6 retorte gradate de 50 ml. În prima retorta se plaseaza 10 ml de solvent B (pct. 3.3), iar în celelalte se plaseaza respectiv 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 și 10,0 ml de soluție standard B de gosipol (pct. 3.6). Se umple conținutul fiecărei retorte până la 10 ml cu solvent B (pct. 3.3). Se incalzeste timp de 30 de minute într-o baie de apa fierbinte. Se raceste la temperatura camerei, se umple volumul cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1) și se omogenizeaza.

Se plaseaza 2,0 ml din aceste soluții în fiecare dintre cele doua serii de 6 retorte gradate de 25 ml. Se umple conținutul retortelor din prima serie până la 25 ml cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1) (serii de referința).

Se adauga 2 ml de anilina (pct. 3.4) în fiecare retorta dintre cele doua serii. Se incalzeste timp de 30 de minute într-o baie cu apa fierbinte. Se raceste la temperatura camerei, se aduce la volum cu amestec de propan-2-ol-hexan (pct. 3.1), se omogenizeaza și se lasă sa stea timp de o ora (serii standard).

Se determina densitatea optica a soluțiilor din seriile standard, asa cum s-a indicat la pct. 5.2, prin comparare cu soluțiile corespunzătoare din seriile de referința. Se traseaza curba de calibrare prin schitarea densitatii optice în raport cu cantitățile de gosipol (în f2æg).

6.3. Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele celor două determinări paralele efectuate pe aceeași proba trebuie să fie de maximum:

a) 15%, în valoare absolută, pentru conținut de gosipol mai mic de 500 ppm;

b) 75 ppm, în valoare absolută, pentru conținut de gosipol de minimum 500 ppm și maximum 750 ppm;

c) 10%, în valoare absolută, pentru conținut de gosipol mai mare de 750 ppm.

Anexa 2 la norma sanitară veterinara

I. DETERMINAREA TILOZINEI

- prin difuziune pe agar -

1. Scop și domeniu de aplicare

Aceasta metoda se utilizează pentru determinarea conținutului de tilozina din furaje, concentrate și premixuri, atunci când este prezenta în cantitate mai mare de 2 ppm.

2. Principiu

Proba trebuie tratata cu o soluție tampon fosfat la pH 8, incalzita anterior la 80°C și apoi extrasa cu metanol. După centrifugare, extrasul trebuie diluat și determinata activitatea antibiotica a acestuia prin măsurarea difuziei tilozinei pe mediu de agar insamantat cu Sarcina lutea. Difuzia este evidențiată prin formarea de zone de inhibitie în prezenta microorganismului. Diametrul acestor zone este direct proporțional cu logaritmul concentratiei de antibiotic.

3. Microorganism: Sarcina lutea ATCC nr. 9341

3.1. Întreținerea tulpinii parentale

Se inoculeaza cu Sarcina lutea un tub de agar înclinat prelevat din mediul de cultura (pct. 4.1), se ajusteaza până la pH 7,0. Se incubeaza peste noapte la aproximativ 35°C. Se tine cultura într-un refrigerator și se reinoculeaza agarul înclinat cu aceasta în fiecare luna.

3.2. Prepararea suspensiei bacteriene

Se colectează bacteriile dintr-o eprubeta cu agar înclinat, recent preparata (pct. 3.1), utilizându-se 2 până la 3 ml de soluție fiziologica salina (pct. 4.4). Cu aceasta suspensie se insamanteaza o retorta Roux ce conține 250 ml mediu de cultura (pct. 4.1), ajustat la pH 7,0. Se incubeaza timp de 24 de ore, la 35°C, apoi se colectează bacteriile în 25 ml de ser fiziologic (pct. 4.4). Se omogenizeaza și se dilueaza aceasta suspensie pentru a se obține o transmisie a luminii de aproximativ 75% la 650 nm.

Aceasta soluție poate fi utilizata timp de o săptămâna, dacă a fost ținuta într-un refrigerator.

Prin teste preliminarii pe plăcuțe cu mediu primar pentru determinare (pct. 4.1) se stabilește cantitatea de inocul care, pentru diferite concentratii de tilozina utilizate, va induce cele mai mari zone de inhibitie posibile ce sunt încă clare. Mediul de cultura este inoculat la temperaturi între 48 până la 50°C.

4. Medii de cultura și reactivi

4.1. Mediu primar pentru determinare (^1)

Glucoza

1 g

Peptona triptica

10 g

Extract de carne

1,5 g

Extract de drojdie

3 g

Agar, conform cu calitatea

10 până la 20 g

Apa distilata

până la 1.000 ml

Se ajusteaza pH-ul la 7, imediat înainte de utilizare, pentru a se întreține tulpina parentala și prepararea suspensiei de bacterii și la pH 8 pentru determinare.

4.2. Soluție tampon fosfat, pH 8

Fosfat de potasiu dehidrogenat

0,523 g

KH(2)PO(4) A.R.

Fosfat de dipotasiu hidrogenat

16,730 g

K(2)HPO(4) A.R.

Apa distilata

până la 1.000 ml

4.3. Soluție tampon fosfat, pH 7

Fosfat de potasiu dehidrogenat

5,5 g

KH(2)PO(4) A.R.

Fosfat de dipotasiu hidrogenat

13,6 g

K(2)HPO(4) A.R.

Apa distilata

până la 1.000 ml

4.4. Ser fiziologic steril.

4.5. Metanol pur.

4.6. Metanol 40% (v/v)

4.7. Amestec de soluție tampon fosfat (pct. 4.2)/ metanol pur: 60/40 ca volum.

4.8. Substanța standard: tilozina cu activitate cunoscută.

5. Soluții standard

Se usucă substanța standard (pct. 4.8) timp de 3 ore la 60°C într-un cuptor cu vacuum (5 mm de mercur). Se cantaresc 10 până la 50 mg într-o retorta gradata, se dizolva în 5 ml de metanol (pct. 4.5) și se dilueaza soluția cu soluție tampon fosfat, pH 7 (pct. 4.3), pentru a se obține o concentrație de tilozina baza de 1.000 f2æg per ml.

Se prepara din aceasta soluție de stoc o soluție standard de lucru S(8) ce conține 2 f2æg per ml de tilozina baza prin diluare cu amestecul (pct. 4.7).

Se prepara apoi prin dilutii succesive (1+1), utilizându-se amestecul (pct. 4.7), următoarele concentratii:

S(4)

1 f2æg/ml

S(2)

0,5 æg/ml

S(1)

0,25 æg/ml

6. Extracție

Pentru concentrate, se ia o proba-test de 10 g; pentru premixuri și furaje, o proba test de 20 g. Se adauga 60 ml de soluție tampon fosfat, pH 8 (pct. 4.2), incalzita anterior până la 80°C, și se omogenizeaza timp de doua minute (cu mixer domestic, Ultra-turrax etc).

Se lasă sa sedimenteze timp de 10 minute, se adauga 40 ml de metanol (pct. 4.5) și se omogenizeaza timp de 5 minute. Se centrifugheaza extractul și se dilueaza o parte alicota cu amestecul (pct. 4.7), pentru a se obține o concentrație prezumtiva de tilozina de 2 f2æg per ml (= U(8)). Se prepara apoi concentratiile U(4), U(2) și U(1) prin dilutii succesive (1 + 1), utilizându-se amestecul (pct. 4.7).

Pentru un conținut mai mic de 10 ppm, se evapora extractul până se usucă, într-un evaporator rotativ la 35°C, și se dizolva reziduul în metanol 40% (pct. 4.6).

7. Metoda de determinare

7.1. Inocularea mediului de cultura

Se inoculeaza mediul primar pentru determinare, la 48 până la 50°C (pct. 4.1), se ajusteaza până la pH 8,0, cu suspensie de bacterii (pct. 3.2).

7.2. Prepararea placilor

Difuzia în agar este efectuată pe plăci, utilizându-se 4 concentratii de soluții standard [S(8), S(4), S(2), S(1)] și 4 concentratii ale extractului [U(8), U(4), U(2), U(1)]. Cele 4 concentratii ale soluției standard și ale extractului trebuie să fie plasate în fiecare placa.

De aceea, se aleg tavi ce sunt destul de mari pentru a permite ca cel puțin 8 godeuri cu diametrul de 10 până la 13 mm să fie realizate în mediu de agar. Se calculează necesarul de mediu de cultura de inoculat (pct. 7.1) pentru a se furniza o acoperire uniforma de aproximativ 2 mm grosime. Testul trebuie să fie efectuat, de preferinta, pe plăci ce constau din plăci plate de sticlă, echipate cu un inel din aluminiu sau plastic perfectat la nivel, cu diametrul de 200 mm și înalt de 20 mm.

Se pipeteaza în godeuri cantitățile măsurate cu acuratete între 0,1 și 0,15 ml de soluție antibiotica, depinzand de diametrul godeurilor.

Pentru fiecare proba se repeta difuzia de cel puțin 4 ori cu fiecare concentrație, în asa fel încât fiecare determinare sa cuprindă o evaluare de 32 de zone de inhibitie.

7.3. Incubare

Se incubeaza tavile peste noapte, la 35 până la 37°C.

8. Evaluare

Se măsoară diametrul zonelor de inhibitie, de preferinta prin proiectare. Se înregistrează măsurătorile pe hârtie semilogaritmica, impartind logaritmul concentratiilor la diametrul zonelor de inhibitie. Se urmăresc liniile soluției standard și ale extractului. Cele doua linii sunt paralele, cu condiția sa nu existe nicio interferenta.

Logaritmul activității relative este calculat utilizându-se următoarea formula:

[U(1) + U(2) + U(4) + U(8) - S(1) - S(2) - S(4) - S(8)] x 0,602

----------------------------------------------------------------

U(4) + U(8) + S(4) + S(8) - U(1) - U(2) - S(1) - S(2)

Activitate reală = activitate prezumată x activitate relativă.

9. Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a doua determinări paralele, efectuate pe aceeași proba, nu trebuie să depășească 10% în valoare relativă.

II. DETERMINAREA VIRGINIAMICINEI

- prin difuziune pe un mediu de agar -

1. Scop și domeniu de aplicare

Metoda se utilizează pentru determinarea virginiamicinei din furaje și premixuri. Limita cea mai joasa de determinare este 2 mg/kg (2 ppm)(^1).

--------

(^1) 1 mg de virginiamicina este echivalent cu 1.000 de unități UK.

2. Principiu

Proba trebuie extrasa cu o soluție metanolica de Tween 80.

Extractul este decantat sau centrifugat și diluat. Activitatea antibiotica a acestuia se determina prin măsurarea difuziei virginiamicinei într-un mediu de agar inoculat cu Micrococcus luteus. Difuzia este relevata prin formarea de zone de inhibitie ale microorganismului. Diametrul acestor zone este estimat a fi direct proporțional cu logaritmul concentratiei de antibiotic peste limita concentratiilor de antibiotic utilizate.

3. Microorganism: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)

3.1. Întreținerea culturii stoc

Se inoculeaza eprubete ce conțin medii de cultura înclinate (pct. 4.1) cu Micrococcus luteus și se incubeaza timp de 24 de ore la 30°C. Se păstrează cultura într-un refrigerator, la aproximativ 4°C. Se reinoculeaza la fiecare doua săptămâni.

3.2. Prepararea suspensiei bacteriene (^a)

--------

(^a) Pot fi utilizate alte metode, cu condiția sa fi fost stabilit ca acestea dau suspensii bacteriene similare.

Se recolteaza creșterea bacteriana dintr-un agar înclinat, recent preparat (pct. 3.1) cu 2 până la 3 ml de soluție de clorura de sodiu (pct. 4.3). Se utilizează aceasta suspensie pentru a se inocula 250 ml de cultura de mediu (pct. 4.1) continuta într-o retorta Roux și se incubeaza timp de 18 până la 20 de ore la 30°C. Se recolteaza creșterea bacteriana în 25 ml de soluție de clorura de sodiu (pct. 4.3) și se amesteca. Se dilueaza suspensia până la 1/10 cu soluție de clorura de sodiu (pct. 4.3). Transmisia de lumina a suspensiei trebuie să fie de aproximativ 75%, masurata la 650 nm, într-o celula de 1 cm, față de soluție de clorura de sodiu. Aceasta suspensie poate fi păstrată timp de o săptămâna, la aproximativ 4°C.

4. Medii de cultura și reactivi

4.1. Mediu de cultura și de proba (^b)

-------

(^b) Poate fi utilizat orice mediu de cultura comercial de compoziție similară și care da aceleași rezultate.

Peptona de carne

6 g

Triptona

4 g

Extract de drojdie

3 g

Extract de carne

1,5 g

Glucoza

1 g

Agar

10 până la 20 g

Apa

1.000 ml

pH 6,5 (după stilizare).

4.2. Fosfat tampon, pH 6

Fosfat acid de potasiu, K(2)HPO(4)

2g

Fosfat diacid de potasiu, KH(2)PO(4)

8g

Apa până la

1.000 ml

4.3. Soluție de clorura de sodiu 0,8% (w/v): se dizolva 8 g de clorura de sodiu în apa și se dilueaza până la 1.000 ml, apoi se sterilizeaza.

4.4. Metanol

4.5. Amestec de fosfat tampon (pct. 4.2)/metanol (pct. 4.4): 80/20 (v/v).

4.6. Soluție metanolica Tween 80 0,5% (w/v): se dizolva 5 g de Tween 80 în metanol (pct. 4.4) și se dilueaza cu metanol până la 1.000 ml.

4.7. Substanța standard: virginiamicina cu activitate cunoscută.

5. Soluții standard

Se dizolva o cantitate din substanța standard cantarita cu acuratete (pct. 4.7) în metanol (pct. 4.4) și se dilueaza cu metanol (pct. 4.4), pentru a se obține o soluție stoc ce conține 1.000 f2æg de virginiamicina per ml.

Depozitata într-o retorta astupata la 4°C, aceasta soluție este stabilă până la 5 zile.

Din aceasta soluție stoc se prepara, prin dilutie succesiva cu amestecul (pct. 4.5), următoarele soluții:

S(8)

1 f2æg/ml;

S(4)

0,5 æg/ml;

S(2)

0,25 æg/ml;

S(1)

0,125 æg/ml.

6. Prepararea extractului și a soluțiilor de testare

6.1. Extracție

6.1.1. Produse cu un conținut de virginiamicina de până la 100 mg/kg

Se cantareste o cantitate din proba de 50 g, se adauga 200 ml de soluție (pct. 4.6) și se agita timp de 30 de minute. Se lasă să se sedimenteze sau se centrifugheaza, se iau 20 ml de soluție de supernatant și se evapora până la aproximativ 5 ml, într-un evaporator rotativ, la o temperatura ce nu depășește 40°C. Se dilueaza reziduul cu amestecul (pct. 4.5), pentru a se obține un conținut de virginiamicina estimat la 1 f2æg/ml [= U(8)].

6.1.2. Produse cu un conținut de virginiamicina mai mare de 100 mg/kg

Se cantareste o cantitate de proba ce nu depășește 10 g și care conține între 1-50 mg de virginiamicina, se adauga 100 ml de soluție (pct. 4.6) și se agita timp de 30 de minute. Se lasă să se sedimenteze sau se centrifugheaza, apoi se dilueaza soluția de supernatant cu amestecul (pct. 4.5), pentru a se obține un conținut de virginiamicina estimat de 1 f2æg/ml [ = U(8)].

6.2. Soluții de proba

Din soluția U(8) se prepara soluții U(4) (conținut estimat: 0,5 f2æg/ml), U 2 (conținut estimat: 0,25 f2æg/ml) și U(1) (conținut estimat: 0,125 f2æg/ml) prin intermediul dilutiei succesive (1+1) cu amestecul (pct. 4.5).

7. Procedura de testare

7.1. Inocularea mediului de testare

Se inoculeaza mediul de testare (pct. 4.1) cu suspensie bacteriana (pct. 3.2) la aproximativ 50°C. Prin teste preliminare pe plăci cu mediu (pct. 4.1) se determina cantitatea de suspensie bacteriana necesară pentru a induce cele mai mari și mai clare zone de inhibitie, cu concentratii variate de virginiamicina.

7.2. Prepararea placilor

Difuzia pe agar este efectuată pe plăci cu 4 concentratii ale soluției standard [S(8), S(4), S(2) și S(1)] și cele patru concentratii ale soluției de testare [U(8), U(4), U(2) și U(1)]. Aceste 4 concentratii de extract și de standard trebuie neapărat să fie plasate în fiecare placa. În acest scop, se selecteaza plăci destul de mari pentru a permite realizarea a cel puțin 8 godeuri cu diametrul de 10 până la 13 mm și de cel puțin 30 mm între centre, ce trebuie realizate în mediu de agar. Testul poate fi efectuat pe plăci ce constau din plăci plate de sticlă echipate cu un inel perfectat la nivel, din aluminiu sau plastic, cu diametrul de 200 mm și înalt de 20 mm.

Se toarna în plăci o cantitate de mediu (pct. 4.1), se inoculeaza ca la pct. 7.1, pentru a se obține o grosime de aproximativ 2 mm (60 ml pentru o placa cu diametrul de 200 mm). Se lasă să se fixeze la o poziție de nivel, se realizează godeurile și se plaseaza în acestea volume măsurate cu exactitate de testare și din soluții standard (între 0,1 și 0,15 ml per gaura, în conformitate cu diametrul). Se replica fiecare concentrație de cel puțin 4 ori, astfel încât fiecare determinare să fie supusă unei evaluări a 32 de zone de inhibitie.

7.3. Incubare

Se incubeaza plăcile timp de 16 până la 18 ore la 30 ± 2°C.

8. Evaluare

Se măsoară diametrul zonelor de inhibitie cu o aproximatie de 0,1 mm. Se înregistrează măsurătorile medii pentru fiecare concentrație pe hârtie grafica semi-logaritmica, relevandu-se logaritmul concentratiilor în legătură cu diametrele zonelor de inhibitie. Se schiteaza liniile cele mai potrivite, atât ale soluției standard, cat și ale extractului. Se determina punctul "cel mai potrivit" pentru nivelul standard cel mai scăzut (SL), utilizându-se formula:

7S(1) + 4S(2) + S(4) - 2S(8)

a) SL = ----------------------------

10

Se determina punctul "cel mai potrivit" pentru nivelul standard cel mai înalt (SH), utilizându-se formula:

7S(8) + 4S(4) + S(2) - 2S(1)

b) SH = ----------------------------

10

Se calculează în mod similar punctele "cele mai potrivite" pentru nivelul cel mai scăzut (UL) al extractului și nivelul cel mai înalt al extractului, inlocuind U(1), U(2), U(4) și U(8) pentru S(1), S(2), S(4) și S(8) în formula anterioară.

Se înregistrează valorile calculate SL și SH pe aceeași hârtie grafica și acestea se unesc, pentru a da linia "cea mai potrivita" pentru soluția standard. Se înregistrează, în mod similar, UL și UH și acestea se unesc, pentru a da linia "cea mai potrivita" pentru extract.

Liniile trebuie să fie paralele în absenta oricărei interferente. Din motive practice, liniile pot fi considerate paralele, dacă valorile (SH - SL) și (UH - UL) nu diferă cu mai mult de 10% din valoarea medie a acestora.

Dacă liniile sunt estimate a nu fi paralele, fie U(1) și S(1) sau U(8) și S(8) pot fi ignorate și SL, SH, UL și UH calculate, utilizându-se formula alternativa, pentru a da liniile alternative "cele mai potrivite":

5S(1) + 2S(2) - S(4)

5S(2) + 2S(2) - S(8)

a') SL = --------------------- sau SL = ---------------------

6

6

5S(4) + 2S(2) - S(1)

5S(8) + 2S(4) - S(2)

b') SH = --------------------- sau SH = ---------------------

6

6

și în mod similar pentru UL și UH. Trebuie să fie îndeplinite aceleași criterii de paralelism. Trebuie să fie notat în raportul final faptul ca rezultatul a fost calculat pornindu-se de la 3 niveluri.

Atunci când liniile sunt considerate ca fiind paralele, se calculează logaritmul activității relative (log A) prin intermediul uneia dintre următoarele formule, depinzand dacă au fost utilizate 3 sau 4 niveluri pentru evaluarea paralelismului.

Pentru 4 niveluri:

[U(1) + U(2) + U(4) + U(8) - S(1) - S(2) - S(4) - S(8)] x 0,602

c) Log A = ---------------------------------------------------------------

U(4) + U(8) + S(4) + S(8) - U(1) - U(2) - S(1) - S(2)

Pentru 3 niveluri:

(U 1 +U 2 +U 4 -S 1 -S 2 -S 4 ) x 0,401

d) Log A = -------------------------------------------

U 4 + S 4 - U 1 - S 1

sau

[U(2) + U(4) + U(8) - S(2) - S(4) - S(8)] x 0,401

d') Log A = ---------------------------------------------------

U(8) + S(8) - U(2) - S(2)

Activitatea extractului de proba = activitatea standardului relevant x A

[U(8) = S(8) x A]

Dacă se constată că activitatea relativă este în afară intervalului 0,5 până la 2,0, atunci se repeta testarea, efectuandu-se ajustarile corespunzătoare la concentratiile extractului sau, dacă acest lucru nu este posibil, la soluțiile standard. Atunci când activitatea relativă nu poate fi adusă în intervalul solicitat, orice rezultat obținut trebuie să fie considerat ca aproximativ și acesta trebuie să fie notat în raportul final.

Atunci când liniile sunt considerate ca nefiind paralele, se repeta determinarea. Dacă paralelismul nu este încă atins, determinarea trebuie să fie considerată ca nesatisfacatoare.

Se exprima rezultatul în miligrame de virginiamicina per kilogram de furaj.

9. Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a doua determinări paralele, efectuate pe aceeași proba, de același analist, trebuie să fie de maximum:

- 2 mg/kg, în valoare absolută, pentru un conținut de virginiamicina de până la 10 mg/kg;

- 20% în relație cu cea mai mare valoare pentru un conținut de 10 până la 25 mg/kg;

- 5 mg/kg, în valoare absolută, pentru un conținut de 25 până la 50 mg/kg;

- 10% în relație cu cea mai mare valoare pentru un conținut de peste 50 mg/kg.

--------