Normele din 26 februarie 2007

Anexa ------

la norma sanitară veterinară

----------------------------

DETERMINAREA AFLATOXINEI B(1)

A. Metodă cromatografică monodimensională în strat subțire

1. Domeniu și scop

Metoda se utilizează pentru determinarea nivelului de aflatoxină B(1) din materii prime și furaje simple. Metoda poate fi aplicată numai dacă în conținutul acestora nu se găsește pulpă de citrice. Limita inferioară a determinării este 0,01 mg/kg (10 ppb).

În prezența substanțelor interferente, este necesară repetarea analizei utilizându-se metoda B (metoda cromatografică de înaltă performanță în fază lichidă).

2. Principiul metodei

Proba se supune extracției cu cloroform. Extractul se filtrează și o porțiune alicotă este preluată și purificată pe coloana cromatografică cu silicagel. Eluatul se evaporă și reziduul se redizolvă într-un volum specific de cloroform sau într-un amestec de benzen și acetonitril.

O porțiune alicotă din această soluție se analizează prin cromatografie în strat subțire (CSS). Cantitatea de aflatoxină B(1) se determină, sub iradierea cu UV a cromatogramei, fie vizual, fie prin fluorodensitometrie, fie prin comparare cu cantități cunoscute de aflatoxină standard B(1). Identitatea aflatoxinei B(1) extrasă din furaj trebuie să fie confirmată prin procedura indicată.

3. Reactivi

NB: Toți reactivii trebuie să fie de calitate "pentru analiză " numai în cazul în care nu s-a stabilit altfel.

3.1. Acetonă

3.2. Cloroform, stabilizat cu 0,5 până la 1,0% etanol 96% (v/v)

3.3. n-hexan

3.4. Metanol

3.5. Eter dietilic anhidru, fără peroxizi

3.6. Amestec de benzen și acetonitril: 98/2(v/v)

3.7. Amestec de cloroform (pct. 3.2) și metanol (pct. 3.4) 97/3(v/v)

3.8. Silicagel, pentru coloana cromatografică, mărimea granulei 0,05 până la 0,20 mm

3.9. Vată de bumbac absorbantă, degresată anterior cu cloroform, sau vată de sticlă

3.10. Sulfat de sodiu, anhidru, granule

3.11. Gaz inert, de exemplu azot

3.12. Acid clorhidric 1 N

3.13. Acid sulfuric 50%(v/v)

3.14. Diatomit (hyflosupercel), spălat în acid

3.15. Silicagel G-HR sau echivalent, pentru CSS

3.16. Soluție standard cu aproximativ 0,1 æg aflatoxină B(1) per ml preparată în cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (pct. 3.6), preparat și verificat așa cum s-a indicat la secțiunea 7.

3.17. Soluție standard pentru scopuri de testare calitativă ce conține aproximativ 0,1 g aflatoxină B(1) și B(2) per ml în cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (pct. 3.6). Aceste concentrații sunt prezentate ca un ghid. Acestea trebuie să fie ajustate astfel încât să se obțină aceeași intensitate de fluorescență pentru ambele aflatoxine.

3.18. Solvenți de developare:

3.18.1. Cloroform (pct. 3.2)/acetonă (pct. 3.1): 9/1(v/v), soluție-mamă nesaturată;

3.18.2. Eter dietilic (pct. 3.5)/metanol (pct. 3.4)/apă: 96/3/1(v/v/v), soluție-mamă nesaturată;

3.18.3. Eter dietilic (pct. 3.5)/metanol (pct. 3/4)/apă: 94/4,5/1,5(v/v/v), soluție-mamă saturată;

3.18.4. Cloroform (pct. 3.2)/metanol (pct. 3.4): 94/6(v/v), soluție-mamă saturată;

3.18.5. Cloroform (pct. 3.2)/metanol (pct. 3.4): 97/3(v/v), soluție-mamă saturată;

4. Aparatură

4.1. Râșniță-mixer

4.2. Aparat de agitat sau agitator magnetic

4.3. Hârtie de filtru cutată, Schleicher și Schull nr. 588 sau echivalent, diametru: 24 cm.

4.4. Tub de sticlă pentru cromatografie (diametru intern: 22 mm, lungime: 300 mm), cu un robinet PTFE și un rezervor de 250 ml

4.5. Rotovapor, prevăzut cu un balon cu fund rotund de 500 ml

4.6. Balon conic de 500 ml, cu bușon rodat de sticlă

4.7. Aparatură pentru CSS

4.8. Plăci de sticlă pentru CSS, 200 x 200 mm, preparate după cum urmează (cantitățile indicate sunt suficiente pentru a acoperi cinci plăci): se pun 30 g silicagel G-HR (3.15) într-un balon conic; se adaugă 60 ml apă, se astupă și se agită timp de un minut. Se împrăștie suspensia pe plăci astfel încât să se obțină un strat uniform de grosime 0,25 mm; se lasă să se usuce la aer și apoi se depozitează într-un exicator ce conține silicagel. În momentul utilizării, se activează plăcile prin ținerea acestora în cuptor la 110°C timp de o oră.

4.9. Lampă UV cu lungime de undă lungă (360 nm). Intensitatea iradierii trebuie să facă posibilă, pentru un spot de 1 ng de aflatoxină B(1), distingerea cu claritate pe o placă CSS la o distanță de 10 cm de lampă.

4.10. Eprubete gradate de 10 ml cu dopuri de polietilenă

4.11. Spectrofotometru UV

4.12. Fluorodensitometru (opțional)

5. Procedură

5.1. Prepararea probei (vezi "Observații", partea C, pct. 1).

Se macină proba astfel încât întreaga cantitate să treacă printr-o sită cu ochiuri de 1 mm (în conformitate cu recomandarea ISO R 565).

5.2. Extracție

Se pun 50 g de probă măcinată, omogenizată într-un tub conic de 500 ml. Se adaugă 25 g de diatomit (3.14), 25 ml de apă și 250 ml de cloroform (pct. 3.2). Se astupă balonul, se agită timp de 30 de minute cu aparatul (4.2) și se filtrează printr-o hârtie de filtru cutată (pct. 4.3). Se înlătură primii 10 ml din filtrat și apoi se colectează 50 ml.

5.3. Curățarea coloanei

Se introduce în capătul inferior al unui tub de cromatografie (pct. 4.4) un dop de vată de bumbac sau de sticlă (pct. 3.9), se umplu două treimi din tub cu cloroform (pct. 3.2) și se adaugă 5 g de sulfat de sodiu (pct. 3.10).

Se verifică dacă suprafața superioară a stratului de sulfat de sodiu este netedă, apoi se adăugată 10 g de silicagel (pct. 3.8) în porțiuni mici. Se agită cu atenție după fiecare adăugare, pentru a elimina bulele de aer. Se lasă în repaus timp de 15 minute și apoi se adaugă cu atenție 15 g de sulfat de sodiu (pct. 3.10). Se lasă lichidul să curgă până când acesta ajunge deasupra suprafeței superioare a stratului de sulfat de sodiu.

Se amestecă 50 ml de extract colectat (pct. 5.2) cu 100 ml de n-hexan (pct. 3.3) și se transferă cantitativ amestecul pe coloană. Se lasă lichidul să curgă până când acesta este exact deasupra suprafeței superioare a stratului de sulfat de sodiu. Lichidul colectat se elimină. Apoi se adaugă 100 ml de eter dietilic (pct. 3.5) și se lasă din nou să curgă până la suprafața superioară a stratului de sulfat de sodiu. În timpul acestor operațiuni debitul trebuie să fie de 8 până la 12 ml per minut și coloana nu trebuie să se usuce. Se elimină lichidul care curge. Se eluează apoi cu 150 ml amestec de cloroform/metanol (pct. 3.7) și se colectează întregul eluat. Acesta se evaporă până aproape de uscare la o temperatură ce nu depășește 50°C și sub un jet de gaz inert (pct. 3.11) cu rotovapor (pct. 4.5). Se transferă cantitativ reziduul, utilizându-se cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen-acetonitril (pct. 3.6), într-o eprubetă gradată de 10 ml (pct. 4.10). Se concentrează soluția sub un jet de gaz inert (pct. 3.11) și apoi se ajustează volumul până la 2 ml cu cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (pct. 3.6).

5.4. Cromatografia în strat subțire

Pe placa cromatografică (pct. 4.8) se aplică spoturi, la 2 cm de la marginea inferioară, la intervale de 2 cm, cu volumele indicate mai jos din soluția standard și din extract:

a) 10, 15, 20, 30 și 40 æl din soluția standard de aflatoxină B(1) (pct. 3.16);

b) 10 æl din extractul obținut la pct. 5.3 și, suprapunându-se pe același punct, 20 æl de soluție standard (3.16);

c) 10 și 20 æl de extras obținut la pct. 5.3.

Se developează cromatograma la întuneric folosind unul din solvenții de developare (pct. 3.18). Alegerea solventului trebuie să fie efectuată în prealabil, prin depozitarea a 25 æl de soluție standard calitativă (pct. 3.17) pe placă. Atunci când se developează cromatograma la întuneric, aflatoxinele B(1) și B(2) trebuie să fie complet separate.

Solvenții se lasă să se evapore la întuneric, după care placa cromatografică plasată la 10 cm de lampă (pct. 4.9) se iradiază cu UV. Spoturile de aflatoxină B(1) dau o fluorescență albastră.

5.5. Determinări cantitative

Se determină fie vizual, fie prin fluorodensitometrie, așa cum este indicat mai jos.

5.5.1. Măsurători vizuale

Se determină cantitatea de aflatoxină B(1) din extract, prin compararea intensității fluorescenței din spoturile de extract cu cea a unuia din spoturile soluției standard. Dacă este necesar, se interpolează. Fluorescența obținută prin suprapunerea extractului din soluția standard trebuie să fie mai intensă decât cea a cantității de 10 æl de extract și trebuie să fie mai mică decât un spot vizibil. Dacă intensitatea fluorescenței dată de cantitatea de 10 æl de extras este mai mare decât cea de 40 æl din soluția standard, se diluează extractul de 10 sau 100 de ori cu cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (pct. 3.6) înainte să fie supus din nou cromatografiei în strat subțire.

5.5.2. Măsurători prin fluorodensitometrie

Intensitatea fluorescenței spoturilor de aflatoxină B(1) se măsoară cu fluorodensitometru (pct. 4.12), la o excitație cu lungime de undă de 365 nm și o emisie cu lungime de undă de 443 nm. Cantitatea de aflatoxină B(1) din spoturile de extract se determină prin compararea intensităților fluorescenței acestora cu cea a spoturilor de aflatoxină B(1) standard.

5.6. Confirmarea identității aflatoxinei B(1)

Confirmarea identității aflatoxinei B(1) din extract se efectuează prin procesele indicate mai jos.

5.6.1. Tratare cu acid sulfuric

Se pulverizează acid sulfuric (pct. 3.13) pe cromatograma obținută la pct. 5.4. Fluorescența spoturilor de aflatoxină B(1) trebuie să se schimbe, sub iradierea UV, din albastră în galbenă.

5.6.2. Cromatografie bidimensională implicând formarea de aflatoxină B(1) -hemiacetat (aflatoxină B(2a))

NB: Operațiunile descrise mai jos trebuie să fie efectuate urmând cu atenție diagrama din figura 3.

5.6.2.1. Aplicarea soluțiilor

Pentru a preveni migrarea fronturilor solventului se trasează pe o placă (pct. 4.8) două linii drepte paralele la două părți marginale (6 cm de fiecare parte). Se marchează soluțiile următoare pe placă utilizându-se pipete capilare sau microseringi:

- în punctul A: un volum al probei de extract purificat, obținută la pct. 5.3, conținând aproximativ 2,5 nm aflatoxină B(1);

- în punctele B și C: 25 æl de soluție standard (pct. 3.16).

5.6.2.2. Developare

Se developează cromatograma în direcția I, la întuneric, utilizând solvent de developare (pct. 3.18.1) (un strat de 1 cm dintr-o soluție-mamă nesaturată) până când frontul de solvent atinge linia limită a solventului.

Se îndepărtează soluția-mamă de pe placă și se lasă să se usuce la întuneric, la temperatura ambiantă, timp de 5 minute. Se pulverizează apoi cu acid clorhidric (pct. 3.12) de-a lungul unei benzi de 2,5 cm înălțime, ce acoperă punctele A și B (indicată prin zona hașurată în figura 3) până se înnegrește, protejând restul plăcii cu o foaie de sticlă. Se lasă să reacționeze timp de 10 minute la întuneric și se usucă cu un curent de aer la temperatură ambiantă.

Se developează apoi cromatograma în direcția II, la întuneric, utilizând solvent de developare (pct. 3.18.1) (un strat de 1 cm dintr-o soluție-mamă nesaturată) până când frontul de solvent ajunge la linia limită a solventului. Se îndepărtează soluția-mamă de pe placă și se lasă să se usuce la temperatura ambiantă.

5.6.2.3. Interpretarea cromatogramei

Se examinează cromatograma sub lumină UV (pct. 4.9) și se verifică următoarele caracteristici:

a) apariția unui spot albastru de aflatoxină B(1) ce provine de la soluția standard aplicată în punctul C (migrare în direcția I);

b) apariția unui spot fluorescent albastru de aflatoxină B(1) (nu reacționează cu acid clorhidric) și un spot fluores-cent albastru mai intens de aflatoxină B(1) -hemiacetat, ambele originare din soluția standard aplicată în punctul B (migrarea în direcția II);

c) apariția de spoturi asemănătoare celor descrise la lit. b) ce provin din extractul din proba aplicată în punctul A. Poziția acestor spoturi este definită mai întâi prin distanța de migrare a aflatoxinei B(1) de la punctul A în direcția I (aceeași ca aceea lucrată prin standardul aplicat la C) și apoi prin distanțele de migrare de acolo în direcția II a aflatoxinei B(1) -hemiacetat (aceeași ca acelea lucrate prin standardul aplicat la B). Intensitățile fluorescenței spoturilor hemiacetate ce provin din extract și din standardul aplicat în punctul B trebuie să se potrivească.

6. Calcularea rezultatelor

6.1. De la măsurătorile vizuale

Conținutul în micrograme de aflatoxină B(1) per kg de probă (ppb) se determină utilizând următoarea formulă:

C x Y x V

----------,

m x X

în care:

Y și X = volumele în microlitri ale soluției standard de aflatoxină B(1) (pct. 3.16) și ale extractului având o intensitate a fluorescenței similară;

C = concentrația în micrograme de aflatoxină B(1) per ml în soluția standard (pct. 3.16);

V = volumul final al extractului în microlitri, permițând orice diluție ce a fost necesară;

m = masa în grame a probei corespondente volumului din extractul supus la curățarea coloanei.

6.2. De la măsurătorile fluorodensitometrice

Conținutul în micrograme de aflatoxină B(1) per kg de probă se determină utilizând următoarea formulă:

C x V

-------,

m x Y

în care:

Y = volumul în microlitri de extract depus pe placă (10 sau 20 l);

C = cantitatea în nanograme de aflatoxină B(1) din spotul de extras (proporțional valorii Y luate), dedusă din măsurători;

V = volumul final al extractului în microlitri, permițând orice diluție ce a fost necesară;

m = masa în grame a probei corespondente volumului din extractul supus la curățarea coloanei.

7. Prepararea și testarea soluției standard (pct. 3.16)

7.1. Determinarea concentrației de aflatoxină B(1)

Se prepară o soluție standard de aflatoxină B(1) în cloroform (pct. 3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (pct. 3.6) cu o concentrație de 8 la 10 æg/ml.

Se determină spectrul de absorbție între lungimile de undă de 330 și 370 nm cu ajutorul spectrofotometrului (pct. 4.11).

Se măsoară densitatea optică (A) la lungimea de undă de 363 nm, în cazul soluției de cloroform, sau la lungimea de undă de 348 nm, în cazul soluției de amestec de benzen/acetonitril.

Pentru soluția de cloroform, concentrația în micrograme de aflatoxină B(1)/ml de soluție se calculează utilizând formula:

312 x A x 1.000

---------------- .

20.600

Pentru soluția formată din amestecul benzen/acetonitril, concentrația în micrograme de aflatoxină B(1) /ml de soluție se calculează utilizând formula:

312 x A x 1.000

--------------- .

19.800

Se diluează după cum este corespunzător, ferit de lumina zilei, pentru a obține o soluție de lucru standard, cu o concentrație de aflatoxină B(1) de aproximativ 0,1 æg/ml. Această soluție este stabilă timp de două săptămâni dacă se păstrează într-un refrigerator la 4°C.

7.2. Testarea purității cromatografice

Se depun pe o placă (pct. 4.8) 5 æl soluție standard de aflatoxină B(1) ce conține 8 până la 10 æg/ml (pct. 7.1). Se developează cromatograma așa cum s-a indicat la pct. 5.4. În lumina UV cromatograma trebuie să indice numai un spot și nu trebuie să fie perceptibilă în zona de depozitare originală nicio fluorescență.

8. Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele, efectuate pe aceeași probă, prin aceeași analiză, trebuie să fie de maximum:

- 25%, corelată cu rezultatul cel mai mare pentru un conținut de aflatoxină B(1) de la 10 și până la 20 æg/kg;

- 5 æg, în valoare absolută, pentru un conținut mai mare de 20 și până la 50 æg/kg;

- 10%, corelată cu valoarea cea mai mare pentru un conținut mai mare de 50 æg/kg.

9. Reproductibilitate

A se vedea "Observații", partea C, pct. 2.

B. Metoda cromatografică de înaltă performanță în fază lichidă (HPLC)

1. Domeniu și scop

Metoda se utilizează pentru determinarea nivelului de aflatoxină B(1) din furaje, incluzându-le și pe cele care conțin pulpă de citrice. Limita inferioară a determinării este 0,001 mg/kg (1ppb).

2. Principiu

Proba se supune extracției de cloroform. Extractul se filtrează și o parte alicotă se purifică printr-un cartuș de florisil și apoi printr-un cartuș C(18). Separarea finală și determinarea sunt realizate cu ajutorul metodei cromatografice de înaltă performanță în faza lichidă (HPLC), utilizând faza inversă cu coloană C(18), urmată de derivatizare postcoloană cu iod în apă și detectare fluorescentă.

Deoarece micotoxinele sunt substanțe extrem de toxice, manipularea trebuie să fie efectuată într-un spațiu cu abur și trebuie luate precauții speciale în cazul în care toxinele sunt în formă uscată datorită caracterului electrostatic al acestora și tendinței de a se dispersa în mediul de lucru.

3. Reactivi

3.1. Cloroform, stabilizat cu etanol 0,5 până la 1%, din masă. A se vedea observația pct. 10.2;

3.2. Metanol pentru HPLC;

3.3. Acetonă;

3.4. Acetonitril pentru HPLC;

3.5. Solvenți pentru eluare: se prepară cu o zi înainte sau îndepărtați ultrasonic aerul din solvenți.

3.5.1. Amestec de acetonă (pct. 3.3) și apă, 98 + 2(v + v).

3.5.2. Amestec de apă și metanol (pct. 3.2), 80+20(v+v).

3.5.3. Amestec de apă și acetonă (pct. 3.3), 85+15(v+v).

3.6. Faza mobilă pentru HPLC

Amestec de apă, metanol (pct. 3.2) și acetonitril (pct. 3.4), 130+70+40(v+v+v).

NB: Compoziția solventului pentru faza mobilă poate avea nevoie să fie ajustată în funcție de coloana HPLC folosită.

3.7. Soluție de iod saturată: se adaugă 2 g la 400 ml apă. Se amestecă cel puțin 90 min. și se filtrează printr-o membrană filtrantă (pct. 4.15). Se protejează de lumină pentru a preveni fotodegradarea.

3.8. Celit 545 spălat în acid sau echivalent

3.9. Cartuș de florisil (ape SEP-PAK) sau echivalent

3.10. Cartuș C(18)(ape SEP-PAK) sau echivalent

3.11. Gaz inert, de exemplu azot

3.12. Aflatoxină B(1) soluție standard în cloroform, concentrație 10 æg/ml. Se verifică concentrația soluției, după cum urmează: se determină spectrumul de absorbție a soluției între 330 și 370 nm cu ajutorul spectrofotometrului (pct. 4.23). Se măsoară absorbanța (A) la un maxim aproape de 363 nm. Se calculează concentrația de aflatoxină B(1) în micrograme per mililitru de soluție, utilizând formula:

312 x A x 1.000

Concentrația (emg/ml) = ----------------- = 13,991 x A

22.300

3.12.1. Aflatoxină B(1) soluție pastă standard în cloroform

Se transferă cantitativ 2,5 ml aflatoxină B(1) soluție standard (pct. 3.12) într-un balon cotat de 50 ml și se aduce la semn cu cloroform (pct. 3.1). Se depozitează soluția într-un loc răcoros (4°C), întunecat, bine sigilat și învelit în folie de aluminiu.

3.13. Aflatoxină B(1) soluții de calibrare HPLC

NB: Pentru pregătirea soluțiilor se folosește sticlă spălată cu acid (a se vedea pct. 4, Aparatură).

3.13.1. Soluție calibrare 4 ng/ml

Se lasă balonul cotat cu soluție standard (pct. 3.12.1) în folia de aluminiu să se încălzească la temperatura camerei (câteva ore). Se transferă cei 400 æl soluție pastă standard (200 ng aflatoxină B1) într-un balon cotat de 50 ml și se evaporă până la uscare într-un curent de gaz inert (pct. 3.11).

Se dizolvă reziduul obținut în aproximativ 20 ml amestec apă/acetonă (pct. 3.5.3.), se adaugă amestec apă/acetonă până la semn și se amestecă bine.

3.13.2. Soluție pentru calibrare 3 ng/ml

Se transferă cantitativ 7,5 ml soluție de calibrare (pct. 3.13.1) într-un balon cotat de 10 ml, se completează până la semn cu amestec apă/acetonă (pct. 3.5.3) și se amestecă bine.

3.13.3. Soluție pentru calibrare 2 ng/ml

Se transferă cantitativ 25 ml soluție de calibrare (pct. 3.13.1) într-un balon volumetric de 50 ml, se completează până la semn cu amestec apă/acetonă (pct. 3.5.3) și se amestecă bine.

Această soluție este, de asemenea, indicată ca standard de referință, pentru a fi utilizată în cazul injectărilor repetitive în timpul HPLC (pct. 5.5).

3.13.4. Soluție pentru calibrare 1 ng/ml

Se transferă cantitativ 2,5 ml soluție de calibrare (pct. 3.13.1) într-un balon volumetric de 10 ml, se completează până la semn cu amestec apă/acetonă (pct. 3.5.3) și se omogenizează.

3.14. Fiolă conținând amestec de aflatoxine B1, B2, G1 și G2 cu concentrația aproximativă de 1, 0,5, 1 și, respectiv, 0,5 æg/ml în 1 ml cloroform

3.14.1 Soluție pentru test cromatografic

Se transferă conținutul fiolei (pct. 3.14) într-un flacon cu opritor din sticlă sau cu capac cu filet. Se transferă 40 æl soluție în tubul de test cu opritor din sticlă (clătit cu acid) (pct. 4.22). Se evaporă cloroformul în curent de gaz inert (3.11) și se dizolvă din nou în 10 ml amestec apă/acetonă (pct. 3.5.3).

3.15. Reactivi pentru testul de confirmare (6)

3.15.1. Soluție saturată de clorură de sodiu

3.15.2. Sulfat de sodiu, anhidru, granulat

4. Aparatură

Atenție! Utilizarea sticlei fără a fi spălată cu acid pentru soluții apoase de aflatoxină poate cauza pierderi. Trebuie să fie acordată atenție deosebită obiectelor din sticlă noi și celor de unică folosință, precum și flacoanelor autoprelevatoare și pipetelor Pasteur. Obiectele de laborator din sticlă ce au intrat în contact cu soluții apoase de aflatoxină trebuie să fie lăsate câteva ore în acid slab (de exemplu acid sulfuric = 2 mol/l), iar apoi trebuie să fie clătite cu apă distilată, pentru a se îndepărta toate urmele de acid (de exemplu de trei ori, verificare cu hârtie pH). În practică, acest tratament este necesar pentru baloanele cu fund rotund (pct. 4.4), baloane cotate, cilindri de măsurare, flacoane sau tuburi folosite pentru soluții de calibrare și extracte finale (în special flacoane pentru autoprelevare) și pipete Pasteur, dacă acestea sunt folosite pentru transferul soluțiilor de calibrare sau al extractelor.

4.1. Râșniță-mixer

4.2. Sită cu orificii de 1,0 mm, (ISO R 565)

4.3. Agitator mecanic

4.4. Evaporator rotativ în vacuum, echipat cu balon cu fund rotund de 150 până la 250 ml

4.5. Injector pentru cromatografie cu lichid de înaltă performanță cu deschidere potrivită pentru injecția a 250 ml. A se urmări instrucțiunile producătorului pentru umplerea parțială sau completă a deschiderii.

4.6. Coloană de analiză HPLC: pachet C(18) 3 æm sau 5 æm

4.7. Pompă fără pulsație pentru reactiv post-coloană de iod

4.8. Piesă în formă de T pentru volume moarte zero, inox (1/16" x 0,75 mm)

4.9. Bobină spiralată de reacție; teflon sau inox. Dimensiunile de 3000 x 0,5 mm până la 5000x0,5 mm sunt cele mai potrivite în combinație cu coloane HPLC de 5 æm sau 3 æm.

4.10. Baie de apă controlată termostatic, ajustată la 60°C, cu posibilitate de reglare a temperaturii mai bună de 0,1°C

4.11. Detector de fluorescență, cu excitația la lungime de undă 365 nm și emisia la 435 nm. (Pentru instrument de filtrare: lungimea de undă a emisiei > 400 nm). Trebuie să fie posibilă detectarea a cel puțin 0,05 ng aflatoxină B(1) . Unele presiuni pot fi recomandate (de exemplu, reductor, bobină din teflon sau inox conectată la borna de ieșire a detectorului), pentru a suprima bulele de aer din celula de flux.

4.12. Dispozitiv de înregistrare

4.13. Integrator electronic (opțional)

4.14. Hârtie filtru cutată cu diametrul de 24 cm, Macherey-Nagel 617 1/4 sau echivalent

4.15. Membrană filtrantă cu dimensiunea porilor de 0,45 æm, Millipore HAWP 04700 sau echivalent

4.16. Balon conic de 500 ml cu opritor din sticlă

4.17. Coloană din sticlă (diametru interior de aproximativ 1 cm, lungime de aproximativ 30 cm) echipat cu vârf Luer

4.18. Robinet de închidere Luer rezistent la cloroform (de exemplu, Bio-rad 7328017, Analytichem A1 6078, J.T. Baker 4514 sau echivalent)

4.19. Seringă rezistentă chimic, racord Luer de 10 ml

4.20. Seringă potrivită pentru injecție HPLC de 250 æl (a se vedea pct. 4.5)

4.21. Microseringă de 100 æl pentru prepararea soluțiilor de calibrare (se verifică prin cântărire ca precizia să fie de aproximativ 2%)

4.22. Tuburi calibrate de 10 ml cu opritor din sticlă

4.23. Spectrofotometru, potrivit pentru măsurători în regiunea spectrală UV

4.24. Echipament pentru testul de confirmare (6)

4.24.1. Pâlnie pentru separare de 100 æl cu robinet de închidere din teflon, spălată cu acid

4.24.2. Bloc pentru încălzire, 40 până la 50°C

5. Procedură

5.1. Prepararea probei

Se macină proba până ce trece prin sită (pct. 4.2).

5.2. Porția pentru test

Se cântăresc 50 g din proba preparată în balonul conic (pct. 4.16).

5.3. Extracție

Se adaugă la porția pentru test 25 g celit (pct. 3.8), 250 ml cloroform (pct. 3.1) și 25 ml apă. Se astupă balonul și se agită 30 de minute cu un agitator mecanic (pct. 4.3). Se filtrează prin hârtie filtru cu caneluri (pct. 4.14). Se colectează 50 ml filtrat. Este necesară prelevarea unei alicote din filtrat și diluarea până la 50 ml cu cloroform, astfel încât concentrația de aflatoxină B(1) să nu fie mai mare de 4 ng/ml.

5.4. Curățare:

Procedura trebuie să fie efectuată fără întreruperi semnificative.

Atenție!

- laboratorul în care sunt făcute analizele trebuie protejat adecvat de lumina zilei prin utilizare de:

(i) folie absorbantă UV pe ferestre în combinație cu lumină slabă (fără raze solare);

(îi) perdele sau jaluzele în combinație cu lumină artificială (tuburile fluorescente sunt acceptate);

- soluțiile ce conțin aflatoxină trebuie protejate de lumină și este indicat a se păstra la întuneric utilizându-se folie de aluminiu.

5.4.1. Purificare Florisil SEP-PAK

5.4.1.1. Pregătirea ansamblului coloană-cartuș

Se montează un robinet de închidere (pct. 4.18) la tija scurtă a cartușului de florisil (pct. 3.9) (a se vedea figura 1). Se spală cartușul și se elimină aerul luând 10 ml cloroform (pct. 3.1) și trecând repede 8 ml prin robinetul de închidere în cartuș, utilizând o seringă (pct. 4.19). Se montează tija lungă a cartușului la coloana din sticlă (pct. 4.17) și se trec cei 2 ml cloroform rămași prin cartuș în coloană. Se închide robinetul. Se extrage seringa.

5.4.1.2. Purificare

Se adaugă filtratul colectat la pct. 5.3 la ansamblul coloană-cartuș și se lasă să se scurgă. Se spală cu 5 ml cloroform (pct. 3.1), apoi cu 20 ml metanol (pct. 3.2). Se îndepărtează eluatul. În timpul acestor operațiuni, se asigură faptul că ansamblul coloană-cartuș nu se usucă.

Se eluează aflatoxină B(1) cu 40 ml amestec acetonă-apă (pct. 3.5.1) și se colectează întregul eluat în balonul cu fundul rotund al evaporatorului rotativ (pct. 4.4). Se concentrează eluatul pe evaporatorul rotativ la 40°C până la 50°C până ce nu se mai distilează acetona. (NB: În acest punct rămân în balon aproximativ 0,5 ml lichid. Experimentele au arătat că după acest punct evaporarea nu mai este necesară, și atunci când rămâne o cantitate de lichid de 0,5 ml acetona nu reprezintă o cantitate semnificativă. Reziduurile de acetonă rămase pot cauza pierderi de aflatoxină B(1) la nivelul cartușului C(18).) Se adaugă 1 ml metanol (pct. 3.2), se agită circular balonul pentru a dizolva aflatoxina B(1) pe lateralul balonului, se adaugă 4 ml apă și se amestecă. Se deconectează și se îndepărtează cartușul. Se clătește coloana de apă și se păstrează pentru etapa de purificare a cartușului C(18).

5.4.2. Purificare C(18) SEP-PAK

5.4.2.1. Pregătirea ansamblului coloană-cartuș

Se montează un robinet de închidere la tija scurtă a cartușului C(18) (pct. 3.10) - figura 1. Se pregătește cartușul și se elimină orice bulă de aer prin trecerea rapidă cu o seringă (pct. 4.19) a 10 ml metanol (pct. 3.2) prin robinet în cartuș (Bulele de aer din cartuș se văd ca petele de lumină pe fond întunecat). Se iau 10 ml apă și se trec 8 ml prin cartuș (A se evita pătrunderea aerului în cartuș în momentul înlocuirii metanolului cu apa). Se montează tija lungă a cartușului la o coloană de sticlă (pct. 4.17) și se trec cei 2 ml apă rămași prin cartuș în coloană. Se închide robinetul. Se extrage seringa.

5.4.2.2. Purificare

Se transferă cantitativ extractul colectat la pct. 5.4.1.2. în coloana de sticlă (pct. 4.17), spălând balonul cu 5 ml amestec apă/metanol (pct. 3.5.2.), lăsând să se scurgă. În timpul acestor operațiuni se asigură faptul că ansamblul coloană-cartuș nu se usucă. (În momentul în care bulele de aer se strâng lângă cartuș se oprește curgerea și se îndepărtează partea de sus a coloanei de sticlă pentru a elimina bulele de aer. Se continuă.) Se elutează cu 25 ml amestec apă/metanol. Se elimină eluatul. Se elutează aflatoxina B(1) cu 50 ml amestec apă/acetonă (pct. 3.5.3) și se colectează tot eluatul într-un balon cotat de 50 ml. Se completează cu apă până la semn și se amestecă: soluția de test rezultată este utilizată pentru cromatografie (pct. 5.5).

Atenție! Filtrarea extractului final anterioară HPLC nu este obligatorie. Dacă se consideră necesar filtrele din celuloză nu trebuie să fie folosite deoarece pot produce pierderi de aflatoxină B(1) . Sunt acceptate filtrele din teflon.

5.5. Cromatografia de înaltă performanță cu lichid

(A se vedea figura 2 pentru setarea echipamentului). A se lăsa suficient timp pentru condiționarea și stabilizarea instrumentelor.

NOTA 1: Debitul de curgere dat de faza mobilă și de reactivul post-coloană are numai rol indicativ și poate fi ajustat în funcție de caracteristicile coloanei HPLC.

NOTA 2: Răspunsul detectorului la aflatoxina B(1) depinde de temperatură, prin urmare derivațiile trebuie compensate (fig. 3). Prin injectarea unei cantități fixe de standard de referință aflatoxină B(1) (pct. 3.13.3) la intervale regulate (de exemplu, la fiecare a treia injectare), valorile picului aflatoxinei B(1) obținute între aceste standarde de referință pot fi corectate utilizând mijloace de răspuns, cu condiția ca diferența dintre răspunsurile standardelor de referință consecutive să fie foarte mică (<10%). De aceea, injectările trebuie să fie efectuate fără întrerupere. Dacă este necesară o întrerupere, ultima injectare înainte de întrerupere și prima injectare după întrerupere trebuie să reprezinte standardul de referință (pct. 3.13.3).

Întrucât curba de calibrare este lineară și trece prin origine, cantitățile de aflatoxină B(1) din extractele din probe sunt determinate direct prin raportare la standardele adiacente.

5.5.1. Setările pompei HPLC

Se setează pompa HPLC (pct. 4.5) la un debit de curgere de 0,5 sau 0,3 ml/min. pentru o coloană HPLC (pct. 4.6) de 5 æm sau de 3 æm, respectiv folosind faza mobilă (pct. 3.6).

5.5.2. Setările pompei post-coloană

Se setează pompa (pct. 4.7) la un debit de curgere de 0,2 până la 0,4 ml/min. pentru soluție saturată apă-iod. Debite de aproximativ 0,4 sau 0,2 ml/min. sunt recomandate în combinație cu debite de 0,5, respectiv 0,3 ml/min. pentru faza mobilă (pct. 3.6).

5.5.3 Detector cu fluorescență

Se setează detectorul cu fluorescență (pct. 4.11) la excitație de 365 nm și emisie de 435 nm (instrument de filtrare; > 400 nm). Se ajustează atenuatorul detectorului pentru a obține aproximativ 80% din totalul devierii vârfului dispozitivului de înregistrare pentru 1 ng de aflatoxină B(1) .

5.5.4. Injector

Pentru toate soluțiile se injectează o cantitate de 250 æl, urmând instrucțiunile producătorului injectorului.

5.5.5. Verificarea separării cromatografice

Se injectează soluția pentru test cromatografic (pct. 3.14.1). Șanțurile trebuie să fie mai mici de 5% din suma înălțimilor muchiilor adiacente.

5.5.6. Verificarea stabilității sistemului

Înaintea fiecărei serii de analize se injectează standardul de referință (pct. 3.13.3) până ce se ating suprafațele stabile ale muchiilor. (NB: Reacția suprafeței de aflatoxină B(1) , între injectări consecutive, nu trebuie să difere cu mai mult de 6%). Se începe imediat verificarea linearității (pct. 5.5.7).

5.5.7. Verificarea linearității

Se injectează soluție de calibrare aflatoxină B(1) (pct. 3.13.1 la pct. 3.13.4).

Pentru evitarea aglomerărilor în reacție, la fiecare a treia injectare se va utiliza standard de referință (pct. 3.13.3) (NB: Reacția suprafeței superioare în cazul acestui standard de referință nu trebuie să difere cu mai mult de 10% în 90 min.). Se corectează aglomerările conform formulei de la punctul 7. Graficul de calibrare trebuie să fie linear și să treacă prin origine între două erori standard pe Y. Valorile obținute nu trebuie să difere cu mai mult de 3% de valorile nominale. Dacă aceste condiții sunt îndeplinite, se continuă fără întârziere. Dacă nu, se identifică și se corectează sursa problemelor de a continua.

5.5.8. Injectarea extractelor din probe

Se injectează extractele din probe purificate (pct. 5.4.2.2). După fiecare două extracte din probe se repetă injectarea de standard de referință (pct. 3.13.3), conform următoarei secvențe: standard de referință, extract, extract, standard de referință, extract, extract, standard de referință etc.

6. Test de confirmare

6.1. Tratarea în continuare a extractului (pct. 5.4.2.2)

Se adaugă 5 ml soluție de clorură de sodiu (pct. 3.15.1) extractului obținut la pct. 5.4.2.2. Se extrag de 3 ori câte 2 ml cloroform (pct. 3.1) pentru un minut, în pâlnia de separare (pct. 4.24.1). Se scurg extractele combinate cu cloroform peste aproximativ 1 g sulfat de sodiu (pct. 3.15.2) într-un tub pentru test de 10 ml. O pâlnie mică (diametru: 4 cm, poate fi folosită împreună cu o cârpă din bumbac în partea de scurgere, acoperită cu aproximativ 1 g sulfat de sodiu.

Se spală stratul de sulfat de sodiu cu câțiva ml cloroform și se colectează soluția rezultată în același tub pentru test. Se evaporă extractul de cloroform până la uscare, în același tub pentru test, utilizând un bloc pentru încălzire (pct. 4.24.2) și se redizolvă în 1 ml cloroform.

6.2. Pregătirea cromatografiei derivate și în strat subțire:

A se vedea metoda A, pct. 5.6.2.

7. Calcularea rezultatelor

Se calculează conținutul de aflatoxină B(1) (æm/kg) prezent în probă, după formula:

m x V(ext)

Conținutul de aflatoxină B(1) în emg/kg = ------------------ ,

V(f)

V(m) x M x

------

V(c)

unde:

m = cantitatea în ng de aflatoxină B(1) reprezentată prin partea superioară B(1) a probei, calculată după cum urmează:

P(proba)

m = ------------------- x 2r(st),

P(st(1)) + P(st(2))

unde:

P(proba) = suprafața superioară a aflatoxinei B(1) pentru probă;

P(st(1)) = suprafața superioară a aflatoxinei B(1) rezultată din injectarea precedentă, cu standard de referință (pct. 3.13.3);

P(st(2)) = suprafața superioară a aflatoxinei B(1) rezultată din injectarea următoare, cu standard de referință (pct. 3.13.3);

r(st) = cantitatea de aflatoxină B(1) în ng injectată în standardul de referință (pct. 3.13.3);

V(m) = volumul în ml extras din probă injectat;

V(ext) = volumul final în ml de extras din probă;

M = masa în g a probei;

V(f) = volumul în ml de filtrat transferat în cartușul florisil (pct. 5.4.1.2);

V(c) = volumul în ml de cloroform utilizat pentru extragerea probei.

Dacă procedura este conformă acestui protocol, formula se reduce la:

conținutul de aflatoxină B(1) în æg/kg = 20 x m.

7.1. Calcularea rezultatelor poate, de asemenea, să fie efectuată măsurând înălțimea suprafeței superioare.

8. Repetabilitate

A se vedea pct. 10.1

9. Reproductibilitate

A se vedea pct. 10.1

10. Observații

10.1. Precizie

Un studiu colaborativ^1) efectuat la nivel internațional asupra furajelor amestecate a ajuns la rezultatele pentru repetabilitate și reproductibilitate indicate în tabelul 1. Termenul repetabilitate (r) utilizat aici este definit ca fiind cea mai mare pondere nesemnificativă la nivelul de probabilitate de 95% pentru compararea a două citiri ale aceleiași probe, în același laborator, în condiții similare. Termenul reproductibilitate (R) este definit similar pentru compararea în cazul a două laboratoare diferite. În conformitate cu ISO 3534 - 1977, 2,35^2) și cu Decizia Comisiei 89/610/CEE^3), r și R sunt dați, de asemenea, în tabelul 1 drept coeficienți de variație.

----

^1) Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. și Paulsch, W.E. (1991). Aditivi și Contaminanți Alimentari 8, 17-29.

^2) ISO 3534-1977

^3) JO nr. L 351, 2.12.1989, p. 39.

Tabelul 1

Repetabilitatea (r) și reproductibilitatea (R) exprimate proporțional și coeficienții de variație corespondenți (15 laboratoare)

Nivel

r

R

CV(r)*)

CV(R)

(μg/kg)

(%)

(%)

8 & 14

1,4

1,7

11

18

----

Caracteristicile de absorbție ale cartușului de florisil pot fi schimbate dacă sunt utilizați alți stabilizatori decât etanolul. Trebuie să fie verificată conformitatea cu pct. 10.3, în cazul în care cloroformul descris nu este disponibil.

10.3. Acuratețe

Aplicarea corectă a metodei trebuie să fie verificată prin efectuarea de măsurători repetate asupra materialelor de referință certificate. În cazul în care acestea nu sunt disponibile, performanța metodei trebuie să fie verificată prin experimente repetate asupra unor probe blank îmbunătățite. Devierea valorii medii de la valoarea actuală, exprimată în procente din valoarea actuală, nu trebuie să depășească limitele de -20% până la +10%.

Figura 1: Ansamblul coloană-cartuș

Figura 2: Schema de curgere a sistemului LC de derivatizare post-coloană cu iod

Figura 3: Compensarea aglomerării în răspunsul aflatoxinei B prin injectarea standardului de referință (3.13.3) la intervale regulate de timp

C. Observații privind metodele A și B

1. Degresare

Probele ce conțin mai mult de 5% grăsimi trebuie să fie degresate cu eter de petrol (bp 40°C până la 60°C) după preparările indicate la pct. 5.1.

În astfel de cazuri, rezultatele analitice trebuie să fie exprimate în funcție de masa probei nedegresate.

2. Reproductibilitatea rezultatelor pentru metoda A

Reproductibilitatea rezultatelor, de exemplu, variația dintre rezultatele obținute în două sau mai multe laboratoare privind aceeași probă, a fost estimată la:

±50% din valoarea medie pentru valorile medii ale aflatoxinei B(1) de la 10 și până la 20 æg/kg;

±10 æg/kg din valoarea medie pentru valori medii mai mari de 20 și până la 50 æg/kg;

±20% din valoarea medie pentru valori medii peste 50 æg/kg.