Normele din 10 aprilie 2002

Capitolul 1 Dispoziții generale

Prezenta norma sanitară veterinara stabilește protocoalele de testare pentru tuberculoza, bruceloza, leucoza enzootica bovina, bluetongue (febra catarala), boala epizootica hemoragica, leptospiroza, rinotraheita bovina infectioasa/vulvovaginita pustulara infectioasa, diareea virala bovina, febra aftoasa, boala lui Aujeszky, gastroenterita transmisibila, influența suina, boala veziculoasa a porcului, pesta porcina clasica, precum și condițiile pentru autorizarea targurilor de animale, fermelor de carantina sau centrelor de colectare pentru comerțul cu animale din speciile bovine sau porcine destinate exportului.

Capitolul 2 Bovine

A. Tuberculoza
1. Următoarele teste vor fi recunoscute ca fiind teste oficiale de tuberculinare intradermica:
a) testul unic intradermic presupune o singura injectare a tuberculinei bovine;
b) testul comparativ intradermic solicita o injectare de tuberculina bovina și o injectare de tuberculina aviara, administrate simultan.
2. Doza de tuberculina injectata va fi:
a) nu mai mica de 2.000 UTC de tuberculina bovina;
b) nu mai mica de 2.000 u.i. de tuberculina aviara W15.
Volumul fiecărei doze injectate nu va depăși 0,2 ml.
3. Testele de tuberculinare se vor efectua prin injectarea tuberculinei/tuberculinelor în pielea gatului. Locurile de injectare vor fi situate la limita dintre treimea anterioară și cea mijlocie a gatului. Când se injecteaza aceluiași animal atât tuberculina bovina, cat și tuberculina aviara locul pentru injectarea tuberculinei aviare va fi la aproximativ 10 cm de linia superioară a gatului și locul pentru injectarea tuberculinei bovine va fi cu aproximativ 12,5 cm mai jos, pe o linie paralela cu linia umarului sau pe părți diferite ale gatului; la animalele ținere la care nu exista loc suficient pe o singura parte a gatului pentru a separa aceste locuri fiecare injecție va fi facuta pe câte o parte laterala a gatului, în locuri identice situate în centrul treimii mijlocii a gatului.
4. Tehnica tuberculinarii și interpretarea reactiilor vor fi următoarele:
4.1. Tehnica tuberculinarii: locul injectarii va fi tuns și dezinfectat. Se va prinde între degetul mare și arătător un pliu al pielii din interiorul zonei tunse și dezinfectate, se va măsura cu sublerul și se va nota valoarea obținută. Un ac scurt, steril, tăiat oblic și atasat la o seringa gradata conținând tuberculina va fi introdus oblic în straturile mai profunde ale pielii. Apoi se va injecta doza de tuberculina. O injectare corecta va fi confirmată prin palparea unei mici ridicaturi asemănătoare unui bob de mazare la fiecare loc de injectare. Grosimea pliului pielii din fiecare zona injectata va fi masurata din nou după 72 de ore de la injectare și va fi notată.
4.2. Interpretarea reactiilor
4.2.1. Interpretarea reactiilor se va baza pe observațiile clinice și pe creșterea/creșterile înregistrată/înregistrate a/ale locurilor de injectare, la 72 de ore după injectarea tuberculinei.
a) Reactia este negativa dacă se observa doar o inflamare limitată, cu o creștere nu mai mare de 2 mm a grosimii pliului de piele, fără semne clinice ca edem difuz sau extins, transpiratie, necroze, dureri sau inflamatii ale canalelor limfatice din regiunea respectiva sau ale limfonodulilor.
b) Reactia este neconcludenta dacă nu se observa semne clinice precum cele menționate la lit. a) și dacă creșterea pliului de piele este mai mare de 2 mm, dar mai mica de 4 mm.
c) Reactia este pozitiva dacă se observa semne clinice precum cele menționate la lit. a) și b) sau dacă creșterea pliului de piele de la locul injectarii este de 4 mm sau mai mare.
4.2.2. Interpretarea testelor oficiale de tuberculinare intradermica va fi următoarea:
4.2.2.1. Testul unic intradermic:
a) pozitiv: o reactie pozitiva ca cea definită la lit. c);
b) neconcludent: o reactie neconcludenta ca cea definită la lit. b);
c) negativ: o reactie negativa ca cea definită la lit. a).
4.2.2.1.1. Animalele care au reactionat neconcludent la testul unic intradermic vor fi supuse unui alt test după minimum 42 de zile.
4.2.2.1.2. Animalele care nu au reactionat negativ la acest al doilea test vor fi considerate ca fiind pozitive la test.
4.2.2.1.3. Animalele care au reactionat pozitiv la testul unic intradermic pot fi supuse unui test comparativ intradermic.
4.2.2.2. Testul comparativ intradermic pentru stabilirea și menținerea statusului de efectiv oficial indemn de tuberculoza:
a) pozitiv: o reactie pozitiva la tuberculina bovina cu 4 mm mai mare decât reactia la tuberculina aviara sau prezenta semnelor clinice;
b) neconcludent: o reactie pozitiva sau neconcludenta la tuberculina bovina, care este cu 1-4 mm mai mare decât reactia la tuberculina aviara, și absenta semnelor clinice;
c) negativ: o reactie negativa la tuberculina bovina sau o reactie pozitiva ori neconcludenta la tuberculina bovina, dar care este egala sau mai mica decât o reactie pozitiva ori neconcludenta la tuberculina aviara, precum și absenta semnelor clinice în ambele cazuri.
4.2.2.2.1. Animalele care au reactionat neconcludent la testul comparativ intradermic vor fi supuse unui alt test după minimum 42 de zile. Animalele care nu au reactionat negativ la acest al doilea test vor fi considerate ca fiind pozitive.
4.2.3. Statutul de efectiv oficial indemn de tuberculoza poate fi suspendat și animalelor din efectiv nu li se va permite sa ia parte la comerțul intracomunitar până la rezolvarea statusului următoarelor animale:
a) animalele care au fost considerate neconcludente la testul unic intradermic de tuberculinare;
b) animalele care au fost considerate pozitive la testul unic intradermic în perioada de asteptare a retestarii cu un test comparativ intradermic;
c) animalele care au fost considerate neconcludente la testul comparativ intradermic.
4.2.4. Atunci când legislația sanitară veterinara solicita ca animalele să fie supuse unui test intradermic anterior miscarii lor, testul va fi interpretat astfel încât nici un animal care prezintă o creștere a grosimii pliului de piele mai mare de 2 mm sau prezintă semne clinice sa nu fie comercializat.
B. Bruceloza
1. Testele de seroaglutinare
1.1. Serul aglutinant standard trebuie să fie conform serului etalon preparat de Veterinary Laboratory Agency, Addlestone, Weybridge, Regatul Unic al Marii Britanii și Irlandei de Nord. Fiola trebuie să conțină 1.000 u.i. aglutinante, obținute prin liofilizarea a 1 ml ser bovin.
1.2. Aprovizionarea cu serul standard trebuie să fie asigurată prin Bundesgesudheitsand, Berlin.
1.3. Titrul aglutinant al serului trebuie să fie exprimat în unități internaționale/ml, de exemplu, serum X = 80 u.i./ml.
1.4. Citirile reacției lente de seroaglutinare în tuburi trebuie făcute la nivelul unei aglutinari de 50% sau 75%, iar antigenul utilizat trebuie să fie titrat în condiții identice față de un ser standard.
1.5. Valorile aglutinante ale diferiților antigeni față de serul standard trebuie să se încadreze în următoarele limite:
a) dacă citirea se face la 50% - între 1/600 și 1/1.000;
b) dacă citirea se face la 75% - între 1/500 și 1/750.
1.6. Pentru prepararea antigenului destinat seroaglutinarii lente în tuburi trebuie folosite tulpinile Weybridge nr. 99 și USDA 1119 sau orice alte tulpini de sensibilitate echivalenta.
1.7. Mediile de cultura folosite pentru întreținerea tulpinilor de laborator, precum și pentru producerea antigenului trebuie să nu producă disociere bacteriana S-R, fiind preferabila folosirea agarului cu cartof.
1.8. Emulsia bacteriana trebuie facuta în soluție salina fiziologica NaCl 0,85 la mie, fenolat 5%. Formolul nu trebuie folosit.
1.9. Institutul oficial responsabil de testarea oficială a antigenilor este Institutul de Diagnostic și Sănătate Animala, str. dr. Staicovici nr. 63, București.
1.10. Antigenii pot fi livrați în forma concentrata cu condiția ca factorul de dilutie care trebuie utilizat să fie indicat pe eticheta flaconului.
1.11. Pentru efectuarea unei reactii de seroaglutinare trebuie preparate cel puțin 3 dilutii pentru fiecare ser. Dilutiile serului suspect trebuie efectuate de asa maniera încât citirea reactiilor la limita de infectie să fie facuta în tubul din mijloc. Dacă exista o reactie pozitiva în acest tub, serul suspect conține minimum 30 u.i. aglutinante/ml.
2. Reactia de fixare a complementului
2.1. Serul standard este același cu cel menționat la pct. 1.1. Pe lângă conținutul sau în unități internaționale aglutinante, 1 ml din acest ser bovin liofilizat trebuie să conțină 1.000 de unități sensibilizante care fixează complementul. Aceste unități sensibilizante sunt denumite unități sensibilizante CEE.
2.2. Serul standard trebuie să fie asigurat prin Bundesgesundheitsand, Berlin.
2.3. Titrul de anticorpi al serului care fixează complementul trebuie să fie exprimat în unități sensibilizante CEE (de exemplu: serul X = 60 de unități sensibilizante CEE/ml).
2.4. Un ser conținând 20 sau mai multe unități sensibilizante CEE/ml (și anume o activitate egala cu 20% din cea a serului standard) trebuie să fie considerat pozitiv.
2.5. Serurile trebuie inactivate după cum urmează:
a) serul bovin: la temperatura de 56-60°C timp de 30-50 minute;
b) serul porcin: la temperatura de 60°C timp de 30-50 minute.
2.6. Tulpina Weybridge nr. 99 sau tulpina USDA 1119 trebuie să fie folosite la prepararea antigenului. Antigenul reprezintă o suspensie bacteriana în ser fiziologic 0,85% NaCl sau în soluție tampon Veronal.
2.7. Pentru efectuarea reacției de fixare a complementului s-a convenit utilizarea unei doze de complement superioare dozei minime necesare unei hemolize totale.
2.8. La efectuarea reacției de fixare a complementului este necesar să se efectueze de fiecare data următoarele controale:
a) controlul efectului anticomplementar al serului;
b) controlul antigenului;
c) controlul eritrocitelor sensibilizate;
d) controlul complementului;
e) controlul sensibilității la declanșarea reacției, utilizându-se un ser pozitiv;
f) controlul specificitatii reacției, utilizându-se un ser negativ.
2.9. Supravegherea și controlul oficial al serurilor standard și al antigenilor trebuie efectuate de organismul menționat la pct. 1.9.
2.10. Antigenii pot fi livrați în stare concentrata, dar cu menționarea factorului de dilutie pe eticheta flaconului.
C. Leucoza enzootica bovina
1. Testul de imunodifuzie în gel de agar pentru leucoza enzootica bovina (LEB)
1.1. Antigenul care va fi folosit în test trebuie să conțină glicoproteine ale virusului LEB. Antigenul trebuie să fie standardizat împotriva unui ser standard (serul El) furnizat de State Veterinary Serum Laboratory, Copenhaga.
1.2. Institutul oficial care trebuie să fie răspunzător de calibrarea antigenului standard de lucru din laborator împotriva serului standard oficial CEE (serul El) furnizat de State Veterinary Serum Laboratory, Copenhaga, este Institutul de Diagnostic și Sănătate Animala, str. dr. Staicovici nr. 63, București.
1.3. Antigenii standard folosiți în laborator trebuie supuși cel puțin o dată pe an, în laboratoarele CEE menționate la pct. 1.2, testarii contra serului standard oficial al CE. Separat de aceasta standardizare antigenul din uz poate fi calibrat conform metodei de standardizare descrise mai jos.
1.4. Reagentii folosiți sunt:
a) antigenul: trebuie să conțină glicoproteine specifice ale virusului LEB, care au fost standardizate contra serului oficial al CEE;
b) serul de testat;
c) serul de control care este cunoscut ca pozitiv;
d) gel de agar: 0,8% agar, 8,5% NaCl, tampon Tris 0,05 M cu pH 7,2. O cantitate de 15 ml din acest gel trebuie introdusă într-o placa Petri cu diametrul de 85 mm, rezultând o grosime de 2,6 mm a agarului.
1.5. Modelul după care se realizează testul consta în taierea în agar a 7 godeuri uscate, până la fundul placii; modelul va consta într-un godeu central și 6 godeuri plasate circular în jurul acestuia după cum urmează:
a) diametrul godeului central = 4 mm;
b) diametrul godeurilor periferice = 6 mm;
c) distanta dintre godeul central și godeurile periferice = 3 mm.
1.6. Godeul central trebuie umplut cu antigen standard. Godeurile periferice 1 și 4 sunt umplute cu ser pozitiv cunoscut, iar godeurile 2, 3, 5 și 6, cu serurile de testat. Godeurile trebuie umplute până la dispariția meniscului.
1.7. Aceste rezultate au fost obținute folosindu-se următoarele cantități:
a) antigen - 32 æl;
b) ser pozitiv - 73 æl ser de control;
c) ser de testat - 73 æl ser care este suspect.
1.8. Incubatia trebuie să dureze 72 de ore la o temperatura a camerei de 20-27°C, într-o încăpere închisă și umeda.
1.9. Testul poate fi citit la 24 și 48 de ore, dar rezultatul final nu poate fi obținut înainte de 72 de ore.
a) Serul testat este pozitiv dacă formează o linie specifică de precipitare cu antigenul virusului LEB și o linie completa de identificare cu serul de control.
b) Serul testat este negativ dacă nu formează o linie specifică de precipitare cu antigenul virusului LEB și dacă nu curbeaza linia produsă de serul de control.
c) Reactia nu poate fi considerată concludenta dacă:
(i) curbeaza linia serului de control spre godeul cu antigenul virusului LEB, fără a forma o linie de precipitare vizibila cu antigenul; sau
(îi) nu poate fi citită ca negativa sau pozitiva.
În reactiile neconcludente testul poate fi repetat folosindu-se un ser concentrat.
1.10. Orice alta configuratie sau model poate fi folosit cu condiția ca serul E4 diluat 1/10 în serul negativ să poată fi detectat ca fiind pozitiv.
1.1.1. Metoda pentru standardizarea antigenului (Soluții și materiale necesare)
1. 40 ml de agar 1,6% în tampon Tris/HCl 0,05% M cu pH 7,2 cu 8,5% NaCl;
2. 15 ml ser contra LEB, conținând anticorpi doar pentru glicoproteinele virusului LEB, diluat 1/10 în tampon Tris/HCl 0,05 M, pH 7,2 cu 8,5% NaCl;
3. 15 ml ser contra LEB având anticorpi doar pentru glicoproteinele virusului LEB, diluat 1/5 în tampon Tris/HCl 0,05 M, pH 7,2 cu 8,5% NaCl;
4. 4 plăci Petri din plastic cu diametrul de 85 mm;
5. un perforator cu un diametru de la 4 mm până la 6 mm;
6. antigen de referința;
7. antigenul care urmează să fie standardizat;
8. o baie de apa la temperatura de 56°C.
1.1.2. Mod de lucru
a) Se dizolva agarul (1,6%) în tampon Tris/HCl, incalzindu-l cu atenție până la temperatura de 100°C. Se tine pe baia de apa timp de aproximativ o ora. De asemenea, se pun dilutiile de ser contra LEB pe o baie de apa.
b) Se amesteca 15 ml din soluția de agar la temperatura de 56°C cu 15 ml ser contra LEB (1/10), scuturand rapid și turnand 15 ml în fiecare dintre cele doua plăci Petri. Se repeta aceasta procedura cu serul contra LEB diluat 1/5.
c) Când agarul s-a intarit se vor practica godeurile și se va face adăugarea antigenilor după cum urmează:
1. plăcile Petri 1 și 3:
a) godeul A - antigen de referința nediluat;
b) godeul B - antigen de referința diluat 1/2;
c) godeurile C și E - antigen de referința;
d) godeul D - antigen de testat nediluat;
2. plăcile Petri 2 și 4:
a) godeul A - antigenul de testat nediluat;
b) godeul B - antigenul de testat diluat 1/2;
c) godeul C - antigenul de testat diluat 1/4;
d) godeul D - antigenul de testat diluat 1/8.
1.1.3. Instrucțiuni suplimentare
a) Experimentul trebuie să fie efectuat cu doua dilutii de ser 1/5 și 1/10 în scopul obținerii precipitarii optime.
b) Dacă diametrul precipitarii este prea mic pentru fiecare dintre cele doua dilutii, este necesară diluarea în continuare a serului.
c) Dacă diametrul precipitarii este prea mare și neclar pentru fiecare dintre cele doua grade de dilutie, atunci va trebui aleasă o dilutie mai mica a serului.
d) Concentrația finala a agarului trebuie să fie de 0,8%, iar cea a serurilor de 5% și, respectiv, 10%.
e) Se noteaza diametrele măsurate în următorul sistem de coordonate. Dilutia de lucru este cea la care s-a înregistrat același diametru pentru antigenul de testat și antigenul de referința.
D. Bluetongue (febra catarala)
1. Testul ELISA de blocare sau competitiv se va efectua conform urmatorului protocol:
a) Testul ELISA competitiv care utilizează anticorpul monoclonal 3-17-A3 este capabil sa detecteze anticorpii tuturor serotipurilor cunoscute ale virusului bluetongue (BTV).
b) Principiul testului consta în întreruperea reacției dintre antigenul BTV și un anticorp monoclonal specific de grup (3-17-A3) prin adăugarea dilutiilor de ser de testare. Anticorpii de BTV prezenți în serul de testare blocheaza reactivitatea anticorpului monoclonal (ACM) și determina reducerea dezvoltării culorii scontate la adăugarea substratului enzimatic.
1.1. Materiale și reactivi:
1. plăci de microtitru cu suprafața plata;
2. antigen pregătit conform procedurii descrise mai sus;
3. tampon de blocare: 5% (w/v) lapte praf deshidratat Marvel, 0,1% (v/v) de tween-20 furnizat sub forma de sirop de polioxietilena sorbiton monolaurat în PBS;
4. anticorp monoclonal: 3-17-A3 (furnizat sub forma de supernatant de cultura tisulara hybridoma), depozitat la temperatura de -20°C sau liofilizat, diluat 1/50 cu tampon de blocare înainte de folosire, dirijat contra polipeptidei p7 specifică grupului;
5. conjugat: globulina de iepure antisoarece (adsorbit și diluat), conjugata cu peroxidaza din hrean și păstrată la loc intunecos la temperatura de 4°C;
6. substrat și cromogen: 0,2 g de ortofenil diamina (OPD) dizolvat într-un tampon de 2,553 g acid citric și 4,574 g disodiu hidrogenortofosfat dizolvat în 500 ml de apa distilata, divizata în alicote de 25 ml și păstrate la loc intunecos la temperatura de -20°C, cu 12 æl/25 ml de peroxid de hidrogen (30% w/v) adăugat imediat înainte de utilizare;
ATENȚIE! A se utiliza OPD cu atenție, a se purta manusi din cauciuc, produs suspect de a fi mutagen.
7. acid sulfuric de 1 mol: 26,6 ml de acid sulfuric adăugat la 473,4 ml de apa distilata;
ATENȚIE! Întotdeauna adaugati acidul peste apa, niciodată apa peste acid.
8. agitator orbital;
9. cititor de placa ELISA (testul poate fi citit vizual).
H
G
F
E
D
C
B
A
Antigen orb + Control conjugat Antigen + Mab Control conjugat
Antigen + conjugat
Antigen + acm + Conjugat
Antigen + Ser pozitiv + acm + Conjugat
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/128
1/256
Ser de testat
Antigen + ser pozitiv + acm + conjugat
1/2
1/4
1/8
1/16
1/2
1/4
1/8
1/16
Seruri de testat
1.2. Protocolul testului:
Control orb: linia 1A-H este un control orb care conține antigen BTV și conjugat. Acesta poate fi folosit la etalonarea cititorului ELISA.
1.3. Control ACM: linia 2A-H este controlul anticorpului monoclonal și cuprinde antigen BTV, anticorp monoclonal și conjugat. Acesta reprezintă un control negativ. Media valorilor densitatii optice ale acestei linii de control reprezintă valoarea de inhibitie 0%.
1.4. Control pozitiv: linia 3A-H este controlul pozitiv. Acesta cuprinde antigen BTV, dilutii de antiser pozitiv BTV, ACM și conjugat și este inclus pentru a indica faptul ca testul este efectuat corespunzător și ca trebuie să se obțină niveluri similare de inhibitie de la un test la altul.
1.5. Serurile de testare: în schema testului prezentată mai sus 18 seruri pot fi testate în dilutii de 1/2, 1/4, 1/8 și 1/16. Acest lucru oferă informații asupra titrului de anticorpi din serurile de testare. Gama de dilutii poate fi largita pentru a obține titruri finale de dilutii ale serului. Alternativ, pentru supraveghere serologica la scara larga, serurile pot fi testate într-o singura dilutie (1/4) sau în doua dilutii 1/2 și 1/4 ca test de control rapid.
1.6. Procedura:
1. Se dilueaza antigen BTV la concentrație pretitrata în PBS, se agita ușor pentru a dispersa virusul agregat (dacă agitatorul nu este disponibil, se pipeteaza puternic) și se adauga 50 æl în toate godeurile placii ELISA. Se agita ușor marginile placii pentru a se dispersa antigenul.
2. Se incubeaza la temperatura de 37°C timp de 60 de minute cu ajutorul unui agitator orbital. Se spala plăcile de 3 ori prin golirea și umplerea godeurilor cu PBS nesteril și se usucă cu ajutorul unei hârtii absorbante.
3. Se adauga 50 æl la fiecare godeu de tampon de blocare. Se adauga serurile de testare și ser pozitiv în godeurile corespunzătoare și se dilueaza pe suprafața placii cu ajutorul unei pipete cu multiple canale. Nu se adauga ser la controlul orb sau controlul acm.
4. Imediat după adăugarea serurilor de testare se adauga acm în tamponul de blocare la dilutie pretitrata și se adauga 50 æl în toate godeurile placii, cu excepția controlului orb.
5. Se incubeaza la temperatura de 37°C timp de 60 de minute într-un agitator orbital. Se spala de 3 ori și cu PBS și se usucă cu ajutorul unei hârtii absorbante.
6. Se dilueaza concentratul de iepure antisoarece la 1/5.000 într-un tampon de blocare și se adauga 50 æl în toate godeurile placii.
7. Se incubeaza la temperatura de 37°C timp de 60 de minute într-un agitator orbital. Se spala de 3 ori și cu PBS și se usucă cu ajutorul unei hârtii absorbante.
8. Se dizolva OPD și imediat înainte de utilizare se adauga 12 æl de 30% apa oxigenata la fiecare 25 ml de OPD. Se adauga 50 æl în toate godeurile placii. Se lasă circa 10 minute să se dezvolte culoarea și se împiedica reactia de 1 ml acid sulfuric 50 æl la godeu. Culoarea trebuie să se dezvolte în godeurile de control ACM și în acele godeuri care conțin saruri fără anticorpi la BTV.
9. Se examinează și se înregistrează plăcile fie vizual, fie cu ajutorul unui cititor spectrofotometric.
1.7. Interpretarea rezultatelor:
a) Se calculează valoarea medie a OD după citirea controalelor acm. Aceasta reprezintă valoarea de inhibitie 0%. Citirile densitatii optice a serurilor de testare sunt exprimate ca valori inhibitoare procentuale, folosindu-se următoarea formula:
OD în prezenta serului de testare
Valoarea de inhibitie procentuală = 100 x ────────────────────────────────────
OD în absenta serului de testare
b) Valorile de inhibitie mai mari de 40% la o dilutie de ser de 1/4 sunt considerate pozitive. Citirea vizuala este posibila având în vedere ca inhibitia de 40% este cea mai mica valoare vizibila.
1.8. Prepararea antigenului BTV ELISA:
1. Se spala de trei ori 10 roux de celule confluente bhk-21 cu un mediu Eagle fără ser și se infecteaza cu serotipul 1 de virus BTV într-un mediu Eagle fără ser.
2. Se incubeaza la temperatura de 37°C și se examinează zilnic pentru efectul citopatic (CPE).
3. Când efectul citopatic este evident în 80-90% din placa de celule din fiecare roux se recolteaza virusul prin agitare pentru a detasa celulele rămase pe sticlă.
4. Se centrifugheaza la 2.000-3.000 rpm pentru a granula celulele.
5. Se indeparteaza supernatantul și se resuspenda celulele în circa 30 ml de PBS conținând 1% sarkosyl și 2 ml de fluorida fenolmetilsulfonil (tampon de distrugere a celulelor). Acest lucru poate cauza o gelificare a celulelor și se pot adauga mai multe tampoane de distrugere a celulelor pentru a reduce acest efect.
ATENȚIE! Fluorura fenolmetilsulfonil este toxica, a se utiliza cu extrema atenție!
6. Se disociaza celulele timp de 60 de secunde cu ajutorul unei sonde ultrasonice la o amplitudine de 30 de microni.
7. Se centrifugheaza la 10.000 rpm timp de 10 minute.
8. Se stocheaza supernatantul la temperatura de +4°C și se resuspenda celulele granulate rămase în 10-20 ml de tampon de distrugere a celulelor.
9. Se agita cu ajutorul unui aparat cu ultrasunete și se clarifica, se stocheaza supernatantul în fiecare stadiu, în total de 3 ori.
10. Se aduna supernatantii și se centrifugheaza la 24.000 rpm timp de 120 de minute, la temperatura de +4°C peste un strat de 5 ml de 40% sucroza w/v în PBS, folosindu-se 30 ml tuburi de centrifugare Beckmann și un rotor SW 28.
11. Se inlatura supernatantul, se dreneaza tuburile și se resuspenda celulele granulate în PBS prin ultrasonare. Se stocheaza antigenul în alicote la temperatura de -70°C.
1.9. Titrarea antigenului BTV ELISA:
Antigenul BTV ELISA este titrat prin ELISA indirect. Doua dilutii de antigen sunt titrate cu ajutorul unei dilutii constante (1/50) de anticorpi monoclonali 3-17-A3. Protocolul este următorul:
1.10. Procedura:
1. Se dilueaza antigen de BTV în PBS peste placa de microtitru într-o serie de doua dilutii 50 æl/godeu cu ajutorul unei pipete cu multiple canale.
2. Se incubeaza timp de o ora la temperatura de 37°C într-un agitator orbital.
3. Se spala plăcile de 3 ori cu PBS.
4. Se adauga 50 æl de anticorp monoclonal 3-17-A3 diluat 1/50 în fiecare godeu al placii de microtitru.
5. Se incubeaza timp de o ora la temperatura de 37°C într-un agitator orbital.
6. Se spala plăcile de 3 ori cu PBS.
7. Se adauga 50 æl de globulina de iepure antisoarece conjugata cu peroxidaza din hrean, diluata la o concentrație optima pretitrata, în fiecare godeu al placii de microtitru.
8. Se incubeaza timp de o ora la temperatura de 37°C într-un agitator orbital.
9. Se adauga substrat și cromogen ca mai sus. Se împiedica reactia după 10 minute prin adăugarea unui mol de acid sulfuric 50 æl/godeu.
1.11. În încercarea concurenta anticorpul monoclonal trebuie să fie în exces, de aceea se alege o soluție de antigen care se găsește pe curba de titrare "nu în zona placii", care da circa 0,8 OD după 10 minute.
2. Testul de imunodifuzie pe gel de agar se va efectua conform urmatorului protocol:
2.1. Antigen: antigenul precipitat este preparat în orice sistem de cultura celulara care suporta rapida multiplicare a serotipului specific de virus BTV. Sunt recomandate celulele BHK și Vero. Antigenul este prezent în fluidul supernatant la finalul creșterii virusului, dar trebuie concentrat de 50-100 de ori pentru a fi eficace. Acest lucru se poate realiza prin orice procedura standard de concentrare proteica; virusul din antigen poate fi inactivat prin adăugarea a 0,3% v/v betapropiolactona.
2.2. Serul de control pozitiv cunoscut: utilizându-se un ser de referința internațional și un antigen, este produs un ser național standard, standardizat la proporții optime în raport cu serul internațional de referința, liofilizat și folosit ca ser de control cunoscut în fiecare test.
2.3. Ser de testare
2.4. Procedura:
a) 1% agaroza preparata în tampon de borat sau barbitol de sodiu, pH 8,5-9,0, este turnata într-o placa Petri la o adancime minima de 3,0 mm.
b) Un ansamblu de testare format din 7 godeuri lipsite de umezeala, fiecare cu diametrul de 5,0 mm, este tăiat în agar. Ansamblul consta într-un godeu central și 6 godeuri dispuse într-un cerc cu raza de 3 mm.
1
6
2
X
5
3
4
c) Se umple godeul central cu antigen standard. Godeurile periferice 2, 4 și 6 sunt umplute cu serul pozitiv cunoscut, iar godeurile 1, 3 și 5 sunt umplute cu ser de testat.
d) Sistemul este incubat timp de 72 de ore la temperatura ambianta într-o camera închisă, umeda.
2.5. Interpretare: un ser de testare este pozitiv dacă formează o linie de precipitina specifică cu antigenul, precum și o linie completa de identificare cu serul de control. Un ser de testare este negativ dacă nu formează o linie specifică cu antigenul și nu curbeaza linia serului de control. Plăcile Petri trebuie examinate pe un fond intunecat și folosind o lumina indirecta.
E. Boala epizootica hemoragica
1. Testul de imunodifuzie pe gel de agar se va efectua conform urmatorului protocol:
1.1. Antigen: antigenul precipitat este preparat în orice sistem de cultura celulara compatibil cu rapida multiplicare a serotipului specific virusului bolii epizootice hemoragice. Sunt recomandate celulele BHK și Vero. Antigenul este prezent în fluidul supernatant la finalul creșterii virusului, dar trebuie concentrat de 50-100 de ori pentru a fi eficient. Acest lucru se poate realiza prin orice procedura standard de concentrare proteica; virusul din antigen poate fi inactivat prin adăugarea a 0,3% v/v betapropiolactona.
1.2. Serul de control pozitiv cunoscut: utilizându-se serul internațional de referința și un antigen, este produs un ser național standard, standardizat pentru a obține o proporție optima în raport cu serul de referința internațional, liofilizat și folosit ca ser de control cunoscut în fiecare test.
Serul de testat
1.3. Procedura: 1% agaroza preparata în tampon de borat sau barbitol de sodiu, pH 8,5-9,0, este turnata într-o placa Petri la o adancime minima de 3,0 mm.
1.4. Un ansamblu de testare format din 7 godeuri lipsite de umezeala, fiecare cu diametrul de 5,0 mm, este tăiat în agar. Ansamblul consta într-un godeu central și 6 godeuri dispuse într-un cerc cu raza de 3 mm, de exemplu:
1
6
2
X
5
3
4
1.5. Godeul central este umplut cu antigen standard. Godeurile periferice 2, 4 și 6 sunt umplute cu serul pozitiv cunoscut, iar godeurile 1, 3 și 5 sunt umplute cu ser de testare.
1.6. Sistemul este incubat timp de 72 de ore la temperatura ambianta într-o încăpere închisă, umeda.
1.7. Interpretare: un ser de testare este pozitiv dacă formează o linie de precipitina specifică cu antigenul, precum și o linie completa de identificare cu serul de control. Un ser de testare este negativ dacă nu formează o linie specifică cu antigenul și nu curbeaza linia serului de control. Plăcile Petri trebuie examinate pe un fond intunecat și folosind o lumina indirecta.
F. Leptospiroza
1. Testul de aglutinare microscopica va fi efectuat conform urmatorului protocol:
1.1. Culturi: trebuie păstrate în mediile Korthof's sau EMJH la temperatura de 30°C.
1.2. Antigen: conține 2 x 10 8 organisme/ml din mediul de cultura.
1.3. Procedura: cantități egale de antigen și ser sunt amestecate în plăci de microtitru cu fund plat și sunt incubate la temperatura de 30°C timp de doua ore sau la temperatura de 37°C timp de 1-1 1/2 h. Testul este citit într-o lumina slabă, pe fond intunecat, folosind o magnitudine între 60x și 100x.
1.4. Interpretare: rezultatul este negativ dacă aglutinarea este mai mica de 50% la o dilutie de 1/50.
G. Rinotraheita bovina infectioasa/vulvovaginita pustulara infectioasa
1. Testul de neutralizare a serului se va efectua conform urmatorului protocol:
1.1. Ser: toate serurile sunt inactivate la temperatura de 56°C timp de 30 de minute înainte de folosire.
1.2. Procedura: pentru testul de seroneutralizare constanta a diferitelor tipuri de virusuri, realizat pe plăci de microtitru, se folosesc celulele MDBK sau alte celule corespunzătoare. Tulpinile Colorado, Oxford sau orice alta tulpina de virus de referința sunt folosite la 100 TCID50 la 0,025 ml; probe de ser nediluat inactivat sunt amestecate cu un volum egal (0,025 ml) de suspensie de virus. Amestecurile de ser/virus sunt incubate timp de 2 ore la temperatura de 37°C în plăcile de microtitru, înainte ca celulele MDBK să fie adăugate. Celulele sunt folosite la o concentrație care formează o monocultura completa după 24 de ore.
1.3. Controale:
a) infectiozitatea virusului;
b) toxicitatea serului;
c) culturi celulare care nu au fost inoculate;
d) antiseruri de referința.
1.4. Interpretare: rezultatele testului de neutralizare și titrul virusului folosit la testare sunt înregistrate după 3-6 zile de incubare la temperatura de 37°C. Titrurile serului sunt considerate negative dacă nu exista nici o neutralizare la o dilutie de 1/2 (ser nediluat).
H. Diaree virala bovina (BVD)
1. Testul de izolare a virusului va fi efectuat conform urmatorului protocol:
a) Materialul de testare și metodele de detectare: se folosesc suspensii de ser, porțiuni retractile de coagul sau coaguli de sânge colectate de la probe de sânge proaspăt, care nu au fost inactivate la cald, prelevate de la animale domestice de mai mult de 6 luni. Se folosește o procedură de colorare imunologica, precum tehnica anticorpului fluorescent (FA) sau ELISA, de exemplu imunoperoxidaza (IPX), pentru a detecta virusul BVD în culturile inoculate.
b) Reactivii de testare: pentru testul FA se cere antiser specific de BVD conjugat cu FITC. Pentru testul IPX se cere ser anti-BVD specific, neconjugat, de origine bovina, antiser antibovin conjugat cu peroxidaza și substrat enzimatic corespunzător (de exemplu: 3-amino-9-etilcarbazol). Se poate folosi ser anti-BVD recoltat de la alte specii decât bovine, cu condiția ca conjugatul de peroxidaza să fie dirijat împotriva globulinelor serice ale speciei respective. Toate serurile antivirale folosite trebuie să aibă o specificitate dovedită și să prezinte o reactivitate mare.
c) Procedura: testul folosește celule susceptibile ca celule turbinate bovine, rinichi de vitel sau testicul de vitel fără virus BVD endogen. Probe de ser: serul de testare și celulele de cultura tisulara sunt plasate în culturi în tuburi acoperite cu dop, în godeuri de plăci de microtitru sau alte containere, astfel încât dilutia finala să fie 10%.
d) Invelisul inflamator și cheagurile de sânge: probele sunt adăugate la culturi celulare monostratificate, confluente și lăsate timp de o ora la temperatura de 37°C, apoi culturile sunt spalate și acoperite de mediu de cultura ce conține 10% ser de fetus de vitel, indemn de BVD. Culturile sunt incubate ulterior la temperatura de 37°C, fixate și colorate prin metodele FA sau IPX.
e) Controale:
1. control pozitiv al virusului BVD;
2. control negativ fără adaos de virus.
f) Interpretare: testul FA este colorat după 4-6 zile de incubare și citit cu ajutorul razelor ultraviolete. Fluorescenta celulelor incubate cu probele de testat este interpretată ca rezultat pozitiv. Testul IPX este colorat după 4 zile de incubare și citit la lumina microscopica. Culoarea maro închis aparuta în citoplasma anumitor celule este interpretată ca rezultat pozitiv.
2. Testul de seroneutralizare serologica va fi efectuat conform urmatorului protocol:
a) Ser: toate serurile sunt inactivate la cald, la temperatura de 56°C, timp de 30 de minute înainte de utilizare.
b) Procedura: testul de neutralizare constanta a diferitelor tipuri de virus pe plăci de microtitru folosește celule bovine corespunzătoare, multiplicate în serii (celule bovine turbinate, descrise de Mcclurkin și alții, 1974, Arch. ges. Virusforch., p. 45, 285-289).
c) Este esențial ca toți reactivii și celulele să fie indemne de virusul BVD/MD necitopatic, accidental contaminante.
d) Virusul de testare, care poate fi orice tulpina corespunzătoare de referința citopatica (de exemplu: tulpina NADL), este folosit la o concentrație de 100 doze infectioase de cultura celulara medie la 0,025 ml. Dilutii de seruri inactivate sunt amestecate cu volume egale de suspensie virala (0,025 ml) și amestecurile de ser-virus sunt incubate timp de o ora la temperatura de 37° înainte de a fi adăugate volume similare de suspensie celulara. Celulele sunt folosite la o concentrație care va forma un monostrat complet după doua zile.
e) Controale:
1. controlul infectiozitatii virusului;
2. controlul toxicitatii serului;
3. controlul culturii celulare neinoculate;
4. antiseruri de referința.
f) Interpretare: cu virusul tulpinii NADL timpul optim pentru citire este după o incubare de 5 zile la temperatura de 37°C.
g) Un titru de neutralizare mediu de 1/10 este considerat indicator al unei reactii imunitare la o infectie anterioară acuta.
I. Depistarea mamitelor
Analiza laptelui va fi realizată conform legislației în vigoare.
J. Febra aftoasa
1. Colectarea probelor de esofag/faringe și testarea lor se vor efectua conform urmatorului protocol:
a) Reactivi: înainte de prelevare este preparat mediul de transport. Se distribuie un volum de 2 ml într-un număr de containere egal cu numărul de animale care vor fi testate. Containerele trebuie să reziste la congelare cu CO(2) solid sau azot lichid. Probele se obțin cu ajutorul unui aparat de recoltat saliva sau prin tehnica "probang". Pentru a obține o proba se plaseaza sonda în gura sub limba și în partea superioară a esofagului. Se incearca frecarea/raclarea suprafeței epiteliului din partea superioară a esofagului și faringelui prin miscari laterale și dorsale. Dispozitivul probang este retras, de preferinta, după ce animalul a inghitit. Sonda trebuie să fie plină și sa conțină un amestec de mucus, saliva, fluid esofagian și fragmente celulare. Se vor lua măsuri ca fiecare specimen sa conțină material celular vizibil. Se vor evita miscarile bruste, care pot provoca sangerari.
Probele prelevate de la anumite animale pot fi puternic contaminate cu conținut ruminal. În acest caz probele sunt indepartate și se spala gura animalului cu apa sau cu lichid fiziologic înainte de repetarea operației.
b) Tratarea probelor: se examinează calitatea fiecărei probe colectate în dispozitivul probang și se adauga 2 ml într-un volum egal cu mediul de transport într-un container rezistent la congelare. Containerele sunt închise ermetic, sigilate, dezinfectate și etichetate. Probele sunt ținute la rece la temperatura de +4°C și examinate după 3-4 ore sau plasate în gheața uscata la temperatura de -69°C sau în azot lichid și păstrate în stare congelata până la examinare. Între doua prelevări se spala și se clateste dispozitivul probang de 3 ori cu apa curata.
c) Testarea virusului FMD: probele sunt inoculate în culturi de celule primare bovine tiroidiene, folosindu-se cel puțin 3 tuburi la o prelevare. Pot fi folosite alte celule asemănătoare, precum celule primare de rinichi de bovine sau porcine, dar trebuie reținut ca aceste celule sunt mai puțin sensibile la anumite tulpini de FMDV. Tuburile sunt inoculate la temperatura de 37°C într-un aparat de rulare și sunt examinate zilnic timp de 48 de ore pentru detectarea prezentei efectului citopatic (CPE). Dacă sunt negative, culturile sunt plasate în alte culturi și reexaminate timp de 48 de ore. Se va confirma specificitatea tuturor CPE.
d) Mijloace de transport recomandate:
1. tampon fosfat de 0,08 M, pH 7,2, conținând 0,01% albumina de ser bovin, 0,002% roșu de fenol și antibiotice;
2. mediu de cultura tisulara (Eagle's MEM) conținând tampon Hepes de 0,04 M, 0,01% albumina de ser bovin și antibiotice, pH 7,2.
e) La mediul de transport trebuie adăugate antibioticele (la ml final):
1. penicilina 1.000 u.i.;
2. sulfat de neomicina 100 u.i.;
3. sulfat de polimixina B 50 u.i.;
4. micostatin 100 u.i.
2. Testul de seroneutralizare a virusului trebuie efectuat conform urmatorului protocol:
a) Reactivi: se prepara antigenul FMDV de stoc în culturi celulare sau pe limba de bovina și se păstrează la temperatura de 70°C, mai mica sau la temperatura de -20°C după adăugarea a 50% glicerol. Acesta constituie antigenul stoc. În aceste condiții FMDV este stabil și titrurile variaza foarte puțin pe o perioadă de câteva luni.
b) Procedura: testul este realizat pe plăci de microtitru cu fund plat, prevăzute pentru culturi celulare, folosind celule sensibile ca IB-RS-2, BHK-21 sau celule de rinichi de vitel.
Serurile de testat sunt diluate 1/4 într-un mediu de culturi celulare fără ser, la care se adauga 100 u.i./ml neomicina sau alte antibiotice adecvate. Serurile sunt inactivate la temperatura de 56°C timp de 30 de minute și se folosesc volume de 0,05 ml pentru prepararea unor serii duble pe plăci de microtitru utilizând 0,05 ml verigi diluante. Se adauga apoi în fiecare godeu virus pretitrat, diluat în mediu de cultura fără ser, conținând 100 TCID50/0,05 ml. După incubare la temperatura de 37°C timp de o ora pentru a permite reactia de neutralizare se adauga în fiecare godeu 0,05 ml de suspensie celulara ce conține 0,5-1,0 x 106 celule la ml într-un mediu de cultura celulara conținând ser fără anticorpi la FMD, după care plăcile sunt sigilate. Plăcile sunt incubate la temperatura de 37°C. Monoculturile devin normal confluente în 24 de ore. CPE este în mod normal suficient de dezvoltat la 48 de ore pentru a permite o citire microscopica a testului. În acest moment se poate efectua o citire microscopica finala sau plăcile pot fi fixate și colorate în vederea unei citiri macroscopice, utilizându-se, de exemplu, 10% formol și 0,05% albastru de metilen.
c) Controale: controalele fiecărui test cuprind antiserul corespunzător al titrului cunoscut, controlul celulelor, controlul toxicitatii serului, controlul mediului și titrul virusului de la care se calculează cantitatea reală a virusului continuta în test.
d) Interpretare: godeurile care prezintă CPE sunt considerate infectate și titrurile de neutralizare sunt exprimate ca reprezentând reciprocă dilutiei finale de ser prezent în amestecurile de ser-virus la punctul final de 50% estimat după metoda Spearman-Karber.
e) Testele sunt considerate valide dacă cantitatea reală de virus folosită la godeu este cuprinsă între 101,5 și 102,5 TCID50 și dacă titrul serului de referința se găsește într-o zona dubla a titrului anticipat, estimat după modul de realizare a titrarilor precedente. Când martorii se găsesc în afară acestor limite se repeta probele. Un titru final de 1/11 sau inferior este considerat negativ.
3. Detectarea și cuantificarea anticorpului prin testul ELISA se va efectua conform urmatorului protocol:
a) Reactivi: antiseruri de iepure împotriva antigenului 146S de 7 tipuri de virus ai febrei aftoase (FMDV) folosite la o concentrație optima predeterminata într-un tampon de carbonat/bicarbonat cu pH 9,6. Se prepara antigeni din tulpinile de virus selectate, cultivate pe celule monocelulare BHK-21. Se utilizează supernatanti nepurificati, pretitrati conform protocolului, dar fără ser pentru a da o dilutie, care după adăugarea unui volum egal de PBST (lichid fiziologic tamponat cu fosfat, conținând 0,05% Tween-20 și indicator roșu fenol) ar da o intensitate optica între 1,2 și 1,5. Virusurile pot fi folosite inactivate. PBST este folosit ca diluant. Se prepara serurile de cobai prin inocularea cobailor cu antigen 146S din fiecare serotip. Se prepara o concentrație optima predeterminata în PBST, ce conține 10% ser normal de bovina și 5% ser normal de iepure. Se folosește imunoglobulina de iepure anticobai conjugata cu peroxidaza din hrean la o concentrație optima predeterminata în PBST, ce conține 10% ser normal de bovina și 5% ser normal de iepure. Serurile de testat sunt diluate în PBST.
b) Procedura:
1. Plăcile ELISA sunt acoperite cu 59 u.i. seruri antivirale de iepure și lăsate peste noapte într-o incinta umeda, la temperatura ambianta.
2. Se prepara 50 æl de duplicat, serii duble din fiecare ser de testat începând cu 1/4 în plăci cu multe godeuri și cu fundul în forma de U (plăci purtătoare). Se adauga în fiecare godeu 50 æl dintr-o doza constanta de antigen și se lasă amestecurile peste noapte la temperatura de 4°C. Adăugarea antigenului reduce dilutia serica inițială la 1/8.
3. Se spala plăcile ELISA cu PBST de 5 ori.
4. Se transfera apoi 50 æl din amestecurile ser-antigen din plăcile purtătoare în plăcile ELISA acoperite cu ser de iepure și se incubeaza la temperatura de 37°C timp de o ora pe un agitator rotativ.
5. După spalare se adauga în fiecare godeu 50 u.i. de antiser de cobai la antigenul folosit la lit. d). Se incubeaza plăcile la temperatura de 37°C timp de o ora pe un agitator rotativ.
6. Se spala plăcile și se adauga în fiecare godeu 50 æl de imunoglobulina de iepure anticobai, conjugata cu peroxidaza din hrean. Plăcile sunt incubate la temperatura de 37°C timp de o ora pe un agitator rotativ.
7. Se spala plăcile și se adauga în fiecare godeu 50 u.i. de ortofenilen diamina, ce conține 0,05% H(2)O(2) 30% p/v.
8. După 15 minute se oprește reactia cu H(2)SO(4) de 1,25 M. Se efectuează citirea spectrofotometrica a placilor la 492 nm cu ajutorul unui cititor ELISA, cuplat la un microordinator.
c) Controale: pentru fiecare antigen utilizat 40 de godeuri nu conțin ser, ci antigen diluat într-un PBST:
1. o serie dubla de doua dilutii de antiser bovin omolog de referința;
2. o serie dubla de doua dilutii de ser bovin negativ.
d) Interpretare: titrurile anticorpilor sunt exprimate ca reprezentând dilutia finala a serurilor de testat, dând 50% din valoarea medie OD înregistrată în godeurile de control al virusului în absenta serului de testat. Titrurile superioare valorii de 1/40 sunt considerate pozitive.

Capitolul 3 Porcine

A. Tuberculoza

Testul tuberculinic intradermic, care utilizează tuberculina aviara, trebuie efectuat în conformitate cu procedurile din cap. II lit. A pct. 1, cu excepția faptului ca locul injectiei va fi pielea fina de la baza urechii.

B. Bruceloza

Testul de seroaglutinare și de fixare a complementului va fi efectuat în conformitate cu cap. II lit. B pct. 1 și 2.

C. Boala lui Aujeszky

Testul de seroneutralizare se va efectua în conformitate cu următorul protocol:

a) Serul: toate serurile sunt inactivate prin încălzire la temperatura de 56°C timp de 30 de minute înainte de utilizare.

b) Procedura: testul de seroneutralizare cu virus constant pe diferite plăci de microtitru folosește sisteme celulare Vero sau alte sisteme celulare senzitive. Virusul bolii lui Aujeszky este utilizat la 100 TCID50 per 0,025 ml; probele de seruri inactivate, nediluate, sunt amestecate cu un volum egal (0,025 ml) de suspensie de virus. Amestecul virus-ser este incubat timp de doua ore la temperatura de 37°C în plăci de microtitru înainte de adăugarea celulelor potrivite. Celulele sunt utilizate într-o concentrație, care formează după 24 de ore un monostrat complet.

c) Controale:

1. verificarea infectiozitatii virusului;

2. controlul toxicitatii serului;

3. controlul culturilor celulare neinoculate;

4. referința antiserului.

d) Interpretare: rezultatele testului de neutralizare și titrul virusului utilizat în test se înregistrează după 3-7 zile de incubare la temperatura de 37°C. Dacă titrul serului este mai puțin de jumătate (material seminal nediluat) testul este considerat negativ.

D. Gastroenterita transmisibila (TGE)

Testul de seroneutralizare va fi efectuat în conformitate cu următorul protocol:

a) Serul: toate serurile sunt inactivate prin încălzire la temperatura de 56°C timp de 30 de minute înaintea utilizării.

b) Procedura: testul de seroneutralizare pe plăci de microtitru folosește celule A72 (tumori de caine) sau alte sisteme celulare sensibile. Virusul TGE se folosește la 100 TCID50 per 0,025 ml; probele de ser inactivate, nediluate, sunt amestecate cu un volum egal (0,025 ml) de suspensie virala. Amestecul virus-ser este incubat 30-60 minute la temperatura de 37°C în plăcile de microtitru înainte de a se adauga celulele potrivite. Celulele sunt utilizate într-o concentrație, care după 24 de ore formează un monostrat complet. Fiecare celula primește 0,1 ml de suspensie celulara.

c) Controale:

1. verificarea infectiozitatii virusului;

2. controlul toxicitatii serului;

3. controlul celulelor neinoculate;

4. referințe antiser.

d) Interpretare: rezultatele testului de seroneutralizare și titrul virusului utilizat în test sunt înregistrate după o incubare de 3-5 zile la temperatura de 37°C. Dacă titrul serului este mai puțin de jumătate (dilutie finala), testul este considerat negativ. Dacă probele de ser nediluat sunt toxice pentru tesuturile de cultura, aceste seruri pot fi diluate 1/2 înainte de a fi utilizate în test. Acesta corespunde unei dilutii finale a serului de 1/4. La titrul serului mai puțin de 1/4 (dilutie finala) testul este considerat negativ.

E. Influența suina

Testul de inhibare a hemaglutinarii se va efectua conform urmatorului protocol:

a) Procedura: testul se realizează prin metode standard pentru distrugerea inhibitorilor nespecifici; serurile suine ar trebui tratate fie cu o enzima care distruge receptorii (filtrat de Vibrio Cholerae), incubata peste noapte la temperatura de 37°C, acest tratament fiind urmat de o reincalzire la temperatura de 37°C timp de 30 de minute pentru distrugerea întregii activități reziduale enzimatice, fie cu 25% kaolina, păstrată pe durata nopții la temperatura de 4°C. După absorbtia cu o suspensie de eritrocite de pasare 10% incubata timp de o ora la temperatura de 37°C, serurile sunt testate cu ajutorul a 4 unități hemaglutinante ale virusului respectiv, utilizându-se eritrocite de pasare 1%. Virusul și serul se lasă în contact timp de 60 de minute la temperatura camerei înainte de adăugarea eritrocitelor.

b) Interpretare: titrurile de 1/10 sau mai mari sunt considerate pozitive.

F. Febra aftoasa

Testele pentru febra aftoasa la porcine se vor efectua conform protocoalelor stabilite în cap. II lit. J.

G. Boala veziculoasa a porcului

Testul de seroneutralizare se va efectua conform urmatorului protocol:

a) Serul: toate serurile sunt inactivate prin încălzire la temperatura de 56°C timp de 30 minute înainte de utilizare.

b) Procedura: testul de seroneutralizare cu virus constant variabil pe plăci de microtitru folosește celule IB-RS-2 sau alte sisteme celulare senzitive G27/72 sau orice alt tip de tulpina utilizata la 100 TCID50 per 0,025 ml. Serurile testate sunt diluate 1/4 și inactivate, apoi se prepara doua serii de dilutii. Probele de ser sunt amestecate cu un volum egal de suspensie virala și incubate timp de o ora la temperatura de 37°C în plăcile de microtitru înainte de adăugarea a 0,025 ml suspensie celulara conținând 3 x 106 celule/ml.

c) Controale:

1. verificarea infectiozitatii virusului;

2. controlul toxicitatii serului;

3. controlul celulelor neinoculate;

4. referința antiserurilor.

d) Interpretare: rezultatul testului și titrul virusului utilizat în test sunt înregistrate după 3-5 zile de incubare la temperatura de 37°C. Titrul serului este considerat negativ dacă nu exista neutralizare la dilutia 1/11.

H. Pesta porcina clasica (PPC)

Recoltarea materialelor pentru diagnostic

1. Pentru izolarea virusului și detectarea antigenilor sunt considerate importante porțiuni de tesut din splina și amigdale. Este de dorit să se recolteze încă cel puțin alte doua tesuturi limfatice (cum ar fi: limfonodulii retrofaringieni, paratiroidieni, mandibulari sau mezenterici) alături de ileon sau rinichi. Fiecare proba de tesut va fi pusă într-o punga de plastic separată, sigilată și etichetata. Probele vor fi transportate și depozitate în containere etanse. Probele nu vor fi congelate, dar vor fi ținute la temperatura de refrigerare și supuse testarii fără întârziere.

2. Probele de sânge pentru izolarea virusului din leucocite se vor recolta de la porci care au febra sau care prezintă alte semne de boala. Ca anticoagulant se va folosi EDTA sau heparina. Probele se păstrează la temperatura de refrigerare și se trimit la laborator fără întârziere pentru efectuarea testelor.

3. Probele de sânge pentru detectarea anticorpilor ca un ajutor pentru diagnosticul clinic în focar sau pentru supravegherea efectivelor vor fi recoltate de la animale care s-au insanatosit după ce au trecut prin infectii suspecte sau de la porci cunoscuți ca au avut contact cu animale infectate sau suspecte. În fiecare exploatatie suspecta tuturor animalelor dintre primele 20 suspecte de boala sau suspecte ca au avut contact cu animale bolnave și la 25% din restul animalelor li se vor recolta probe de sânge. În ideea asigurării unei foarte mari probabilitati de detectare a anticorpilor probele vor fi recoltate din fiecare unitate a exploatatiei.

Diagnosticul de laborator al PPC

1. Bazele diagnosticului de laborator al PPC constau în evidentierea antigenilor virali, a virusului sau a anticorpilor prezenți în organe ori fluide tisulare.

2. În cazul unor rezultate neconcludente testele vor fi repetate pe aceleași probe. Dacă suspiciunile clinice continua, se vor recolta probe suplimentare din aceleași surse.

3. Testele serologice pentru evidentierea anticorpilor pot fi folosite ca un criteriu secundar de diagnostic al cazurilor suspecte de PPC. Dacă evidentierea antigenilor virali sau izolarea virusului nu s-a putut realiza pe materialele provenite de la animale care au dat naștere suspiciunii de PPC sau cu materiale din exploatații care au avut contact cu cazuri de PPC, testele pentru evidentierea anticorpilor se vor efectua pe probe de sânge de la animale care nu mai sunt suspecte și de la animale suspecte de a fi avut contact cu boala.

Evidentierea antigenului viral

1. Pentru evidentierea antigenului viral din porțiuni de tesut din organe din tesuturi imunocompetente trebuie să fie utilizata tehnica prin care se obțin secțiuni subtiri la criostat de până la 5 microni, din tonsile sau din alte organe menționate la titlul "Recoltarea materialelor pentru diagnostic". Reagentul de diagnostic trebuie să fie un antiser policlonal specific - pestivirus - pentru virusul PPC, marcat cu fluorocrom (marcaj luminiscent), cu o enzima sau cu biotina, în conformitate cu următoarele criterii:

a) serul hiperimun va fi preparat de la porci care sunt liberi de infectii, iar serul lor nu conține nici un fel de anticorpi care ar putea afecta specificitatea sau calitatea reactiilor;

b) imunoglobulinele marcate, preparate din ser hiperimun PPC de porc, după cum se menționează la lit. a), vor avea un titru minim de lucru de 1/20, determinat pe culturi celulare infectate cu virusul PPC și confirmat prin teste de verificare pe secțiuni de tesut. Dilutia de lucru a conjugatului trebuie să combine maximum de semnal cu minimum de colorare a fondului.

2. Orice proba care indica o reactie citoplasmatica specifică va fi considerată pozitiva pentru pestivirus. În asemenea cazuri testele ulterioare trebuie efectuate conform descrierii de la titlul "Teste serologice pentru diagnosticul diferential dintre PPC și alte pestivirusuri".

Izolarea virusului și identificarea în culturi celulare

1. Izolarea virusului din probe de tesut se face pe culturi celulare sensibile PK 15 sau pe alte linii celulare la fel de sensibile (susceptibile). Suspensia din organul provenit de la animalul suspect se va inocula la dilutia de 1/10.

2. Izolarea virusului din probe de sânge, recoltat și manipulat după cum este indicat la titlul "Recoltarea materialelor pentru diagnostic", se realizează prin inocularea culturilor celulare cu o suspensie de globule albe, reconstituita până la volumul original de sânge.

3. Pentru detectarea antigenului viral în citoplasma inoculatelor aceste culturi celulare trebuie tratate cu un antiser policlonal marcat. Colorarea trebuie să se realizeze la intervale de 24 și 72 de ore din momentul inocularii.

4. Culturile pozitive trebuie să facă obiectul testelor de diagnostic diferential, după cum se specifică la titlul "Teste serologice pentru diagnosticul diferential dintre PPC și alte pestivirusuri". Rezultatele negative după primul pasaj pe culturi celulare determina efectuarea unui al doilea pasaj sau chiar a mai multor pasaje pentru izolarea virusului.

Tipajul pestivirusurilor izolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali

1. Duplicatele secțiunilor tisulare criostatice sau ale culturilor celulare care prezintă reactii pozitive cu serul policlonal antivirus descris la titlurile "Evidentierea antigenului viral" și "Izolarea virusurilor și identificarea în culturi celulare" vor fi examinate din nou cu ajutorul anticorpilor monoclonali marcati, pentru a diferentia virusul PPC de virusul diareei virale bovine sau al bolii mucoaselor (BVD/MD).

2. Trebuie să se utilizeze numai anticorpii monoclonali recomandați oficial de către laboratorul comunitar de referința pentru pesta porcina clasica.

3. Anticorpii monoclonali trebuie să fie grupati în 4 liste, conform următoarelor criterii:

Numărul grupei

Reactivitate

1.

...........................

Toate virusurile pestoase

2.

...........................

Toate virusurile PPC

3.

...........................

Sușe ale vaccinului contra PPC

4.

...........................

Toate virusurile BVD/MD

Fiecare lista poate fi reprezentată fie printr-un singur anticorp monoclonal, fie de un melanj de anticorpi monoclonali, astfel încât spectrul de reactivitate sa corespundă celui indicat anterior.

4. Interpretarea profilului reacției poate fi rezumata astfel:

Tabel

Interpretare

1

2

3

4

+

+

-

-

PPC confirmat

+

+

+

-

PPC tulpină vaccinală

+

-

-

+

Virus BVB/MD

Detectarea anticorpilor antivirali ai pestei porcine clasice

1. Detectarea anticorpilor antivirali PPC în esantioanele de sânge se efectuează pentru a veni în sprijinul diagnosticarii pestei porcine în unități cu porci care prezintă semne clinice de boala sau pentru a decela boala la porcii recunoscuți a fi avut contacte cu porci infectati. Aceasta proba poate fi efectuată în egala măsura la sfârșitul perioadei de supraveghere sau pentru a controla efectivele al căror statut este necunoscut.

2. Pentru aceasta, probele de sânge trebuie să fie supuse unui test aprobat. Următoarele teste sunt aprobate pentru utilizare și trebuie să comporte includerea serurilor de control pozitive și negative. Susele de virus de utilizat pentru testele serologice trebuie să fie agreate de laboratorul de referința comunitara pentru pesta porcina clasica.

Testul de neutralizare a virusului

1. Acest test se bazează pe determinarea titrului neutralizant 50% final. Se inoculeaza culturile cu un amestec din serul diluat și o cantitate constanta de virus după o perioadă specifică de incubare la temperatura de 37°C. Rezultatele se bazează pe absenta unei replicari virale detectabile printr-un sistem de anticorpi marcati. Se poate utiliza fie testul de neutralizare - imunofluorescenta, fie de neutralizare - imunoperoxidaza.

2. În scopul detectarii se vor dilua inițial serurile 1/10. Dacă este necesară o titrare completa, se prepara dilutii ale serului în baza doi începând cu dilutia 1/10. Fiecare dilutie se amesteca cu un volum egal de suspensie de virus care conține 100 "10,5 10 g 10 doze infectante" "TCID50". Se utilizează pentru fiecare dilutie cel puțin două culturi. După o perioadă corespunzătoare de incubare culturile celulare se fixează și antigenul viral se poate detecta printr-un procedeu de colorare cu ajutorul anticorpilor marcati. Rezultatele se exprima prin reciprocă dilutiei inițiale a serului pentru care jumătate din culturile de celule inoculate nu prezintă coloratie specifică. Se estimeaza titrul la zona dintre doua dilutii.

Metoda imunoenzimatică (ELISA)

1. Se pot utiliza pe orice suport adecvat tehnici competitive, prin blocaj sau indirecte, pentru ca testele utilizate sa reducă la minimum reactiile incrucisate cu virusul diareei virale bovine și cu alte pestivirusuri. Totuși sistemul de testare trebuie să garanteze identificarea tuturor infectiilor datorate PPC și a tuturor stadiilor răspunsului imunitar față de infectie.

2. Antigenul trebuie să provină din proteine virale ale unuia dintre susele recomandate de virus al PPC sau care să îi corespundă. Celulele utilizate la prepararea antigenului trebuie să fie indemne față de orice infectie indusa de pestivirusuri.

3. Antiserurile policlonale pentru probele prin competiție sau prin blocare trebuie să se producă pe porci sau iepuri infectati cu una dintre susele recomandate ale virusului PPC sau prin susa C lapinizata. Anticorpii monoclonali trebuie să fie dirijati contra unei proteine virale imunodominante a virusului PPC sau sa îi corespundă acesteia.

4. Testele indirecte trebuie să utilizeze un ser antiimunoglubuline de porc care să detecteze IgG și IgM.

5. Sensibilitatea testului ELISA trebuie să fie suficient de ridicată pentru a da o reactie pozitiva cu toate serurile active în testul de neutralizare, precum și cu serurile pozitive de referința furnizate de laboratorul comunitar de referința pentru PPC.

6. Metoda ELISA nu poate fi utilizata decât cu probe de ser sau plasma care să provină de la porci individuali.

7. Dacă metoda ELISA nu este specifică PPC, probele pozitive trebuie să facă obiectul testelor diferentiale suplimentare, asa cum sunt descrise la titlul "Teste serologice pentru diagnosticul diferential dintre PPC și alte pestivirusuri".

Evaluarea rezultatelor testelor de laborator

1. Punerea în evidenta a antigenului virusului PPC în tesuturile organelor sau în culturi celulare după izolarea virusului din esantionul de tesut conform tehnicilor descrise la titlurile: "Evidentierea antigenului viral", "Izolarea virusului și identificarea în culturi celulare" și "Tipajul pestivirusurilor izolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali" constituie baza confirmării prezentei bolii, în afară de cazul în care se demonstreaza ca reactia se datorează virusului vaccinal definit în conformitate cu titlul "Tipajul pestivirusurilor izolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali". Punerea în evidenta a antigenului anti-BVD/MD în conformitate cu titlul "Tipajul pestivirusurilor izolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali" infirma suspiciunea de PPC, precum și faptul ca suspiciunea nu se bazează pe alte cauze. În cazul unor rezultate neobisnuite sau neașteptate ale tipizarii prin anticorpi monoclonali, conform titlului "Tipajul pestivirusurilor izolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali", componentele de pestivirus izolate trebuie să fie considerate neclasificate, iar efectivul de origine este considerat suspect până la efectuarea altor teste. Virusul se va trimite laboratorului comunitar de referința în scopul caracterizarii și al realizării anchetelor serologice în efectivele de origine.

2. În cazul detectarii anticorpilor care reactioneaza cu virusul PPC efectivul de origine va fi considerat suspect.

a) Pentru a infirma suspiciunea de PPC care poate să apară prin detectarea anticorpilor, testul descris la titlul "Teste serologice pentru diagnosticul diferential dintre PPC și alte pestivirusuri" se utilizează pentru a stabili o distincție între anticorpii care reactioneaza la PPC, susceptibili de a fi indusi de alte pestivirusuri, și anticorpii virusului PPC, indusi chiar de acesta. Toate probele originale trebuie să facă obiectul unui test diferential.

b) Dacă suspiciunea nu poate fi exclusa cu ocazia primului test diferential, trebuie efectuat un alt test cu cel puțin 30 de zile mai târziu, pentru a detecta o posibila propagare a infectiei. Se vor ridica probe de la primele 20 de animale din ferma suspecta și de la 25% dintre animalele rămase în efectiv.

Interpretarea rezultatelor serologice

1. Un titru de neutralizare a virusului superior sau egal cu 1/10 la oricare dintre porci, asociat cu un parametru clinic sau epizootologic care să permită să se suspecteze boala, constituie un diagnostic pozitiv. Un titru superior sau egal cu 1/10 la oricare dintre porcii care nu se asociaza cu nici un simptom clinic sau epizootologic permite suspectarea bolii și trebuie să fie urmat de un diagnostic diferential.

2. Aceleași criterii trebuie să fie aplicate oricărui porc care prezintă un rezultat pozitiv la testul ELISA.

Teste serologice pentru diagnosticul diferential dintre PPC și alte pestivirusuri

1. Testele pentru diagnosticul diferential între PPC și alte infectii induse de un pestivirus se bazează pe titrari în paralel ale serului, utilizându-se atât suse de virusuri PPC, cat și suse de virusuri BVD/MD și folosindu-se metode strict comparabile.

a) Susele de virusuri PPC și de virusuri BVD/MD folosite au fost anterior aprobate oficial (conform titlului "Detectarea anticorpilor antivirali ai pestei porcine clasice"). Pentru a exclude orice suspiciune de PPC datorată detectarii de anticorpi, esantioanele sanguine vor fi examinate prin titrarea comparativa a anticorpilor virusului PPC și virusurilor BVD/MD.

b) În testul ELISA blocat se poate utiliza compararea dintre procentajele inhibate de către antigenii PPC și BVD/MD.

2. Rezultatele testelor serologice comparative care utilizează suse de referința de PPC și alte pestivirusuri vor fi interpretate astfel:

a) dacă testele comparative arata ca mai mult de un porc prezintă anticorpi ai virusului PPC, dar nici un anticorp contra altor pestivirusuri, rezultatul testului este considerat pozitiv în ceea ce privește PPC;

b) dacă testele comparative releva ca titrurile în ceea ce privește PPC sunt egale sau superioare titrurilor altor pestivirusuri la mai mult de un porc, se suspicioneaza PPC, iar diferentierea se efectuează astfel:

1. acei porci care prezintă titruri neutralizante în ceea ce privește virusul PPC superioare sau egale titrurilor neutralizante ale altor pestivirusuri vor fi sacrificati. Tesuturile lor și, dacă este vorba de gestante, fetusii vor fi supuși unei examinari pentru punerea în evidenta a antigenului sau virusului PPC, conform procedurii descrise la titlurile: "Evidentierea antigenului viral", "Izolarea virusului și identificarea în culturi celulare" și "Tipajul pestivirusurilor izolate cu ajutorul anticorpilor monoclonali";

2. dacă se deceleaza antigenul viral sau virusul PPC, se confirma PPC;

3. dacă testarea vizata la pct. 2 nu permite revelarea prezentei antigenului virusului PPC, unitatea va fi considerată suspecta, până când o noua serie de probe sanguine prelevate cu cel puțin 30 de zile mai târziu va fi supusă unor noi teste comparative;

4. dacă aceste teste comparative ulterioare arata ca toate animalele prezintă titruri neutralizante sensibil mai mari (de 4 ori sau mai mult) contra virusului BVD/MD/BD decât virusul PPC, suspiciunea se infirma;

5. dacă unul sau mai multe animale prezintă un titru în ceea ce privește PPC egal sau superior titrului dat de virusul BVD/MD, rezultatul se considera pozitiv în ceea ce privește PPC;

c) dacă titrurile în ceea ce privește BVD/MD se prezintă astfel încât nu putem exclude posibilitatea prezentei PPC, unitatea va fi considerată suspecta și va fi testata din nou după minimum 30 de zile.

Diagnosticul diferential în pesta porcina africana

1. Pesta porcina africana (PPA) nu poate fi diferențiată de pesta porcina clasica prin examene clinice sau postmortem. Aceste maladii trebuie luate în considerare în diagnosticul diferential al oricărui sindrom hemoragic febril acut la porcine. Testele de laborator sunt esențiale pentru a face diferența dintre cele doua maladii. Un diagnostic pozitiv într-o țara indemna de PPA trebuie să se bazeze pe izolarea și identificarea virusului PPA. Baza principala a diagnosticului de laborator în PPA trebuie să o constituie punerea în evidenta a virusului, antigenului viral sau a anticorpilor în organe și secretiile tisulare. În cazul unor rezultate neconcludente sau negative, pentru mai puțin de doua teste efectuate pe esantioane din animalele suspecte de PPA sau pe material care să provină din ferme care au fost în contact cu cazuri de PPA, se va preleva material suplimentar din aceeași unitate și de la animale care au fost în contact cu boala.

2. Evidentierea antigenului viral

Pentru evidentierea antigenului viral, pentru examinarea secțiunilor fine criostatice din tesuturile organelor sau din materialul etalat ori a sedimentelor culturilor leucocitare se utilizează tehnica de imunofluorescenta directa sau alte tehnici asemănătoare. Metodele utilizate sunt similare celor descrise pentru PPC, cu excepția faptului ca se folosesc reactivi specifici pentru PPA.

3. Izolarea și identificarea virusului

a) Testul de hemadsorbtie (HAD)

Testul de hemadsorbtie se efectuează prin inocularea suspensiei tisulare 10% sau a sângelui colectat pe teren de la porcii suspecti în culturi leucocitare primare de porc sau prin prepararea unor culturi leucocitare din sânge ce provine de la porci febrili, inoculate în laborator sau prelevate pe teren. Hemadsorbtia consta în aglutinarea unui mare număr de eritrocite de porc la suprafața celulelor infectate și confirma diagnosticul de PPA.

b) Inocularea porcilor

Se obține un amestec format din picaturi din suspensii tisulare 10%, din care se inoculeaza pe cale intramusculara câte 2 ml/porc, la 4 porci, dintre care 2 au fost vaccinati contra pestei porcine clasice și 2 nu au fost vaccinati. În fiecare zi se ia temperatura rectala a animalelor pentru a se constata creșterea acesteia și debutul semnelor clinice, pe o perioadă de 21 de zile. În cazul apariției febrei se ridica probe de sânge în vederea preparării culturilor leucocitare destinate testului de hemadsorbtie ("autorosette" și inocularea culturilor leucocitare primare de porc). Dacă nu apare nici un simptom clinic, se iau probe de sânge în scopul detectarii de anticorpi după o perioadă de observatie de 21 de zile.

c) Detectarea anticorpilor indusi de virusul PPA în probele de ser și în secretiile tisulare

Detectarea anticorpilor în probele de ser sau în secretiile tisulare se realizează pentru a contribui la diagnosticarea PPA în crescatoriile cu porci care prezintă simptome clinice care permit suspectarea bolii sau la porcii recunoscuți a fi avut un contact cu porci infectati cu PPA. Ea se poate efectua în scopul supravegherii sau anchetarii în efectivele cu statut necunoscut. Pentru acest scop esantioanele ridicate sunt supuse unui test aprobat. Sunt agreate și trebuie să se efectueze cu seruri-martor pozitive și negative corespunzătoare următoarele teste:

- testul de imunofluorescenta (IFI);

- ELISA.

I. Leptospiroza

Testele pentru leptospiroza la porcine se vor efectua în conformitate cu cap. II lit. F.