Normele din 10 octombrie 2002

Articolul 2

Dispoziții generale relative la inspecțiile sanitare veterinare clinice, la colectarea și selecționarea probelor pentru supravegherea zonelor sau unităților situate în zone neagreate, în scopul obținerii sau menținerii agrearii pentru SHV și/sau NHI

a) Inspecțiile sanitare veterinare clinice și prelevarile de tesuturi de peste și/sau lichid ovarian se efectuează în zone sau unități situate în zone neagreate, în vederea obținerii sau menținerii agrearii pentru SHV și/sau NHI, în conformitate cu

Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 494/2001 . Alte detalii sunt prezentate în art. 3-5. Schemele de inspecție și recoltare prevăzute în anexele nr. 1 și 2 nu se aplică unor unități noi sau unităților care acum încep activitatea cu peste, icre sau lapti care provin din zone agreate sau din unități agreate situate în zone neagreate, cu condiția ca ele sa îndeplinească cerințele prevăzute în

Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 494/2001 .

b) Inspecțiile clinice trebuie să fie efectuate în cursul perioadei cuprinse între lunile octombrie și iunie sau când temperatura apei este inferioară celei de 14°C. Atunci când unitățile trebuie să facă obiectul unei inspecții clinice de doua ori pe an, intervalele dintre inspecții trebuie să fie de cel puțin 4 luni. Toate unitățile de producție (bazine, cuve, viviere etc.) trebuie să fie supuse unei inspecții destinate sa stabilească prezenta de pești morți, agonici sau cu comportament anormal. O atenție particulară trebuie să fie acordată punctului de evacuare a apei, unde pestii agonici au tendinta să se acumuleze în curentul de apa.

c) Pestii care se preleveaza sunt selecționați după cum urmează:

1. dacă sunt prezenți pastravi curcubeu, singurii care se preleveaza sunt aceștia; dacă aceștia nu sunt prezenți, prelevarea se compune din toate speciile prezente, în măsura în care aceste specii sunt sensibile la virusurile SHV și/sau NHI și în conformitate cu

Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 494/2001 ; în proba speciile trebuie să fie reprezentate proporțional;

2. dacă mai mult de o sursa de apa este utilizata pentru producția de peste, în proba prelevata trebuie să fie incluși pestii care să reprezinte toate sursele de apa;

3. dacă sunt pești în agonie, cu comportament anormal sau pești morți recent, dar nu descompusi, aceștia trebuie selecționați în primul rând; dacă acești pești nu sunt prezenți, proba prelevata trebuie să fie compusa din pești cu aspect anormal, aparent sanatosi, din toate zonele din unitate, astfel ca toate clasele de vârsta să fie reprezentate proporțional în proba.

Articolul 3

Dispoziții specifice, incluzând colectarea probelor, relative la supravegherea zonelor sau unităților din zonele neagreate, în scopul obținerii agrearii pentru SHV și/sau NHI

a) O zona sau o exploatatie dintr-o zona neagreata, plasata sub controlul serviciilor sanitare veterinare, poate obține agrearea pentru SHV și/sau NHI cu condiția să se supună unuia dintre următoarele doua programe:

1. Modelul A - Program de supraveghere pentru 2 ani. După cel puțin 2 ani de absenta a unui semn clinic de SHV și/sau NHI, toate unitățile dintr-o zona sau orice unitate dintr-o zona neagreata destinată agrearii trebuie să facă obiectul unei inspecții sanitare veterinare de doua ori pe an, timp de 2 ani. În timpul acestei perioade de control de 2 ani care precede obținerea agrearii, absenta oricărui semn clinic de SHV și/sau NHI trebuie să fie continua, iar prelevarile de probe să se efectueze în conformitate cu anexa nr. 1. În plus, probele trebuie să fie selecționate, prelucrate și examinate conform dispozițiilor art. 2-5, iar examenele de laborator trebuie să fie negative pentru SHV și/sau NHI;

sau

2. Modelul B - Program de supraveghere pentru 2 ani, cu o mărime redusă a probei prelevate. Ca urmare a unui program de inspecții sanitare veterinare oficiale care poate dovedi absenta SHV și/sau NHI pentru cel puțin 4 ani, toate unitățile din zona sau orice unitate dintr-o zona neagreata, destinată agrearii, trebuie să facă obiectul unei inspecții sanitare veterinare de doua ori pe an, timp de 2 ani. În cursul acestei perioade care preceda obținerea agrearii, absenta semnelor clinice sau a altor semne de SHV și/sau NHI trebuie să fie continua, iar probele se preleveaza pentru examen în conformitate cu anexa nr. 2. În plus, prelevarile trebuie să fie selecționate, pregătite și examinate conform dispozițiilor art. 2-5, iar examenele de laborator să fie negative pentru SHV și/sau NHI.

Pentru ca un program de inspecții sanitare veterinare să fie recunoscut de către serviciile sanitare oficiale ca făcând dovada absentei anterioare a SHV și/sau NHI, trebuie să îndeplinească și să respecte criteriile stabilite în partea a III-a.

b) Dispoziții speciale sunt aplicabile în unitățile nou-agreate și în unitățile care încep activitatea cu pești, icre sau lapti provenind dintr-o zona agreată sau dintr-o unitate agreată dintr-o zona neagreata.

Unitățile noi sau unitățile care își încep activitatea cu pești, icre sau lapti provenind dintr-o zona agreată sau unitate agreată din zona neagreata pot obține agrearea în conformitate cu

Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 494/2001 . În consecința, dispozițiile de prelevare sunt stabilite în conformitate cu modelele A și B prevăzute la lit. a) de mai sus.

Articolul 4

Program de supraveghere pentru menținerea agrearii pentru SHV și/sau NHI

În scopul menținerii agrearii într-o zona sau într-o unitate dintr-o zona neagreata pentru SHV și/sau NHI, inspecțiile și prelevarea probelor pentru examen trebuie să se efectueze în conformitate cu anexa nr. 3. Probele trebuie să fie selecționate, pregătite și examinate în conformitate cu dispozițiile art. 2-5, iar rezultatele examenelor de laborator să fie negative pentru SHV și/sau NHI.

Articolul 5

Pregătirea și expedierea probelor de peste

a) Înainte de a fi expediate sau transferate către laborator, se preleveaza de la pești organe sau fragmente de organe cu ajutorul instrumentelor de disectie și se transfera în tub de plastic steril conținând mediu de transport - mediu de culturi celulare cu 10% ser fetal bovin și antibiotice. Se recomanda combinatia de 200 UI penicilina, 200 æg streptomicina și 200 æg kanamicina/ml, dar în aceeași măsura pot fi utilizate și alte antibiotice cu eficacitate demonstrata. Tesuturile pentru examinat sunt splina, rinichiul anterior și, după caz, cordul sau encefalul. În anumite cazuri trebuie examinat lichidul ovarian, în conformitate cu anexele nr. 1-3. Lichidul ovarian sau fragmente de organe de la maximum 10 pești - anexele nr. 1-3 - pot fi comasate într-un tub steril conținând 4 ml mediu de transport și care să reprezinte un esantion (pool) global. Tesuturile din fiecare pool trebuie să fie în cantitate de cel puțin 0,5 g.

b) Tuburile cu probe se introduc într-un recipient izolat, de exemplu o cutie de polistiren cu pereții grosi, cu o cantitate suficienta de gheața, care să garanteze refrigerarea probelor pe timpul transportului până la laborator. Trebuie evitata congelarea probelor. Temperatura probei pe timpul transportului nu trebuie să depășească 10°C, recipientul de transport trebuie să mai conțină gheața când ajunge la destinație, iar blocul refrigerator trebuie să fie parțial sau total congelat.

c) Examenul virusologic trebuie să înceapă imediat sau cat mai curând posibil, cel târziu în 48 de ore de la prelevarea probelor. În cazuri excepționale, de exemplu atunci când pestii provin din zone indepartate, fără posibilitate de expediere zilnica, examenul virusologic poate fi efectuat în 72 de ore de la colectarea materialului de examinat, cu condiția ca acesta să fie protejat cu mediu de transport, iar condițiile de temperatura pe timpul transportului să fie cele indicate mai sus. Se pot expedia și pești vii. Condițiile de ambalare și etichetare trebuie să respecte reglementările naționale sau internaționale în vigoare în materie de transport, dacă este cazul.

Articolul 6

Colectarea de material suplimentar pentru diagnostic

De comun acord cu Institutul de Diagnostic și Sănătate Animala, și alte probe pot fi colectate și pregătite în vederea examenelor suplimentare.

Articolul 7

Congelarea în cazuri excepționale

Dacă exista dificultăți obiective, precum condiții climaterice defavorabile, zile nelucrătoare, probleme de laborator, care împiedica inocularea celulelor în primele 48 de ore de la colectarea probelor de tesut, este admis ca probele să fie congelate în mediu de cultura la -20°C sau la o temperatura inferioară, iar examenul virusologic să se efectueze într-o perioadă de 14 zile. Totuși proba nu poate fi congelata și decongelata decât o singură dată înaintea examinării. Este necesar să se țină un registru în care să fie menționate cauzele fiecărei congelari a probelor de tesut, de exemplu furtuni, linii celulare moarte etc.

Articolul 8

Omogenizarea organelor

În laborator, tesuturile trebuie să fie complet omogenizate cu ajutorul unui stomacher sau cu mojar și nisip steril, după care produsul se introduce în mediul de transport original. Dacă proba este compusa din pești întregi mai mici de 4 cm lungime, aceștia se fragmenteaza cu foarfecele steril după ce se elimina coada din spatele anusului. Dacă proba este constituită din pești cu dimensiuni de 4-6 cm, se colectează viscerele și rinichiul. Dacă pestii sunt mai mari de 6 cm, tesuturile se recolteaza conform prevederilor cap. I art. 4. Probele de tesut se reduc la fragmente mici cu ajutorul foarfecelui steril sau bisturiului, se omogenizeaza și se introduc în mediul de transport, asa cum s-a menționat mai sus. Raportul final între materialul tisular și mediul de transport trebuie să fie de 1:10.

Articolul 9

Centrifugarea omogenatului

a) Omogenatul este centrifugat în centrifuga cu răcire, la o temperatura cuprinsă între 2-5°C la 2.000-4.000 x g, timp de 15 minute, iar lichidul supernatant este colectat și tratat, fie 4 ore la 15°C, fie peste noapte la 4°C, cu antibiotice; de exemplu, 1 mg gentamicina/ml poate fi foarte util în acest stadiu. Dacă proba a fost expediată în mediu de transport - adică sub antibiotic -, tratamentul lichidului supernatant nu mai este necesar. Tratamentul cu antibiotic vizează împiedicarea contaminarii bacteriene a probei și face inutila filtrarea prin filtru cu membrana. Dacă lichidul supernatant colectat este congelat la -80°C în curs de 48 de ore de la prelevarea probei, acesta poate fi utilizat o singură dată pentru examen virusologic.

b) Dacă exista dificultăți obiective - incubator defect, probleme cu mediile de cultura celulare - care împiedica inocularea celulelor în primele 48 de ore de la prelevarea probelor de tesut, este admis ca lichidul supernatant să fie congelat la -80°C, iar examenul virusologic să fie executat în maximum 14 zile. Înainte de a inocula celulele, se amesteca supernatantul cu părți egale cu un pool de antiser contra serotipurilor indigene de virus al necrozei pancreatice infectioase - NPI -, diluat într-o maniera adecvată și incubat timp de minimum o ora la 15°C sau maximum 18 ore la 4°C. Titrul antiserului trebuie să fie cel puțin 1/2.000 într-un test de neutralizare a plajelor cu 50% - reducerea plajelor. Tratamentul efectuat prin inocularea cu ser antivirus NPI la culturile celulare - virus care în anumite regiuni din Europa este prezent în 50% din probele de peste - vizează împiedicarea apariției unui efect citopatic dat de NPI în respectivele culturi celulare. Acest tratament permite reducerea duratei examenului virusologic, astfel ca numărul de cazuri în care apare efectul citopatic să fie considerat ca un indicator potențial de SHV și/sau NHI. Atunci când probele provin dintr-o unitate considerată indemna la NPI, tratamentul cu ser antivirus NPI poate fi omis.

Articolul 10

Culturile celulare și mediile de cultura

a) Linii celulare Bluegill fry - BF2 - sau Rainbow trout gonad - RTG2 - și Epithelioma papulosum cyprini - EPC - sau Fathead minnow - FHM - sunt crescute la temperaturi de 20-30°C în mediu corespunzător, de exemplu Eagle's MEM sau modificări ale acestuia, cu un supliment de ser fetal bovin de 10% și antibiotice în concentratii standard.

b) Când celulele sunt cultivate în sisteme închise, este recomandat ca mediul să fie tamponat cu bicarbonat de sodiu. Mediul folosit pentru cultivarea celulelor în sisteme deschise poate fi tamponat cu Trishidroximetil aminometan - Tris-HCI, 23 mM și bicarbonat de sodiu, 6 mM; pH-ul trebuie să fie 7,6 ± 0,2.

c) Culturile celulare folosite pentru inocularea cu omogenat de tesuturi trebuie să fie ținere, 4-48 de ore, și în faza de creștere, neconfluente, la inoculare.

Articolul 11

Inocularea culturilor celulare

a) Suspensia de organe tratata cu antibiotice este inoculata pe culturi celulare în doua dilutii, de exemplu dilutia primara și în plus o dilutie de 1:10 din aceasta, rezultând dilutii finale ale omogenatului de organe în mediul de culturi celulare de 1:100 și, respectiv, 1:1.000, în scopul prevenirii interferentei omologilor. Cel puțin doua linii celulare trebuie să fie inoculate în conformitate cu prevederile art. 10 lit. a). Raportul dintre volumul inoculului - suspensia de organe tratata cu antibiotice - și volumul mediului de culturi celulare trebuie să fie de aproximativ 1:10.

b) Pentru fiecare dilutie și fiecare linie celulara trebuie să fie utilizata o suprafața de aproximativ 2 cmc, corespunzând unui godeu dintr-o placa cu 24 de godeuri. Folosirea plăcuțelor cu godeuri este recomandată, dar sunt acceptate, de asemenea, și alte suporturi cu suprafața de creștere similară sau mai mare.

Articolul 12

Incubarea culturilor celulare

a) Culturile celulare inoculate sunt incubate la temperatura de 15°C pentru 7-10 zile. Dacă culoarea mediului culturilor celulare virează de la roșu la galben, indicând o acidifiere a mediului, se va ajusta pH-ul mediului cu soluție sterila de bicarbonat de sodiu sau substanțe echivalente, pentru a asigura susceptibilitatea culturii celulare la infectie.

b) La fiecare 6 luni sau dacă este suspectata scăderea susceptibilitatii celulare, se va efectua calcularea titrului stocurilor de virusuri inghetate pentru SHV și NHI, pentru a verifica susceptibilitatea culturilor celulare la infectie. O procedura recomandată este prezentată în partea a IV-a.

Articolul 13

Microscopia

Culturile celulare inoculate trebuie să fie inspectate zilnic sau cel puțin de trei ori pe săptămâna, cu scopul de a urmări apariția efectului citopatic, cu un grosisment între 40 x la 150 x. Dacă efectul citopatic este evident, se începe imediat procedura de identificare a virusului în conformitate cu partea I cap. IV.

Articolul 14

Subcultivarea

a) Dacă nu se produce nici un efect citopatic în prima incubație de 7-10 zile, se procedează la o subcultivare pe culturi celulare proaspete, utilizându-se o suprafața celulara similară cu cea din cultura primara.

b) Cantitatea de mediu - lichid supernatant - care provine din toate culturile/godeurile ce constituie cultura primara este adunata într-un pool pentru fiecare linie celulara, la 7-10 zile după inoculare. Esantioanele - pool-urile - sunt apoi inoculate pe culturi celulare omoloage, nediluat și diluat 1/10, rezultând în final dilutii ale supernatantului de 1:10 și 1:100, astfel cum este descris în art. 11. Părți de 10% din mediul ce constituie cultura primara sunt inoculate direct într-un godeu cu culturi celulare proaspete, subcultivare godeu la godeu. Inocularea poate fi precedată de o preincubare a dilutiilor cu antiser contra virusului NPI în dilutii corespunzătoare, în conformitate cu cap. II art. 9.

c) Incubarea următoare, timp de 7-10 zile la 15°C, se face în conformitate cu art. 12.

d) Dacă se produce un efect citopatic toxic în primele 3 zile de incubație, se poate realiza o subcultivare în acest stadiu, dar celulele trebuie să fie incubate 7 zile, urmată de o subcultivare cu durata de incubație tot de 7 zile. Atunci când se produce un efect citopatic toxic după 3 zile, celulele pot fi pasate o dată și incubate pentru a obține un total de 14 zile de la prima inoculare. Nu trebuie să existe semne de toxicitate în cursul ultimelor 7 zile de incubație.

e) Dacă se produce o contaminare bacteriana în ciuda tratamentului cu antibiotice, subcultivarea trebuie precedată de o centrifugare la 2.000-4.000 x g timp de 15-30 de minute, la temperatura de 2-5°C, și/sau de o filtrare a supernatantului cu un filtru - membrana cu procent scăzut de absorbție a proteinei - de 0,45 æm. În plus față de acest aspect, procedurile de subcultivare sunt aceleași ca și cele care se aplică în cazul apariției efectului citopatic toxic.

Articolul 15

Teste de identificare virala

Dacă se observa apariția de efect citopatic în culturile celulare, mediul de cultura - supernatantul - este colectat și examinat prin una dintre următoarele tehnici: neutralizare, imunofluorescenta, ELISA.

Dacă prin aceste teste nu se definitiveaza identificarea virusului într-o săptămâna, supernatantul trebuie să fie trimis la un laborator național de referința sau la laboratorul de referința al Uniunii Europene pentru bolile pestilor, în vederea identificarii imediate.

Articolul 16

Neutralizarea

a) Se indeparteaza celulele din supernatantul colectat, prin centrifugare la 2.000-4.000 x g sau filtrare prin membrana de 0,45 æm cu procent scăzut de absorbție a proteinelor, și se dilueaza supernatantul 1:100 și 1:10.000 în mediu de culturi celulare.

b) Părți din cele doua dilutii ale supernatantului sunt amestecate separat și incubate pentru 60 de minute la 15°C cu părți egale din următorii reagenti:

1. ser ce conține anticorpi anti virusul SHV la dilutie 1:50, vol:vol;

2. ser ce conține anticorpi anti virusul IHN la dilutie 1:50, vol:vol;

3. pool de antiser anti serotipurile indigene la virusul IPN la dilutie 1:50, vol:vol;

4. doar mediu - martor pozitiv.

c) 50 æl din fiecare amestec format din supernatantul cu virusul de identificat și ser se inoculeaza pe cel puțin două culturi celulare și se incubeaza la 15°C. Se urmărește apariția efectului citopatic asa cum este descris în art. 13.

d) Unele tulpini de virus SHV nu reactioneaza la testele de neutralizare. Astfel de izolate trebuie să fie identificate prin imunofluorescenta - IF - sau ELISA.

e) Pot fi utilizate alternativ și alte teste de neutralizare cu eficienta dovedită.

Articolul 17

Imunofluorescenta - IF

a) Pentru fiecare izolat viral care trebuie să fie identificat este necesar să se cultive cel puțin 8 lamele sau echivalentul, cu celule la o densitate care să asigure o confluenta de aproximativ 60-90% după 24 ore de la cultivare. Linia celulara EPC este recomandată pentru acest scop datorită aderentei sale puternice la suprafețele de sticlă, dar pot fi folosite, de asemenea, și alte linii celulare cum sunt BF2, RTG2 sau FHM.

b) Virusul care trebuie să fie identificat se inoculeaza când celulele s-au prins pe suprafața de sticlă, la aproximativ o ora după tripsinizare, sau când culturile au fost incubate până la 24 ore. Patru culturi sunt inoculate la un raport volum la volum de 1:10 și patru culturi la un raport de 1:1.000. Acestea sunt apoi incubate la 15°C pentru 20-30 de ore.

c) După incubație, culturile sunt clatite de doua ori în mediu Eagle's MEM fără ser fetal, se fixează în 80% acetona rece și se coloreaza apoi prin tehnica de imunofluorescenta indirecta - IFAT. Primul strat de reagent este reprezentat de anticorpi monoclonali sau policlonali la o calitate de referința. Al doilea strat de reagent este reprezentat de un antiser - antiimunoglobulinele utilizate în primul strat -, conjugat cu fluorocrom. Pentru fiecare dintre antiserurile testate se utilizează cel puțin o cultura inoculata cu doza crescută și o cultura inoculata cu doza scăzută. Este necesară includerea în test a martorilor pozitivi și negativi. Este recomandată folosirea fluorocromilor fluorescein izotiocianat - FITC - sau tetrametil-rodamin-izotiocianat - TRITC.

d) Lamelele cu culturi celulare tratate cu reagentii de mai sus se monteaza în glicerol salin. Se examinează la microscop cu sursa de lumina ultravioleta - UV. Se utilizează oculare de 10 x sau 12 x și obiective de x 25 sau x 40 cu apertura mai mare de 0,7 și, respectiv, de 1,3.

e) Tehnica de IF descrisă mai sus este un exemplu. Pot fi aplicate și alte tehnici de IF a căror eficacitate a fost dovedită: culturi celulare, fixare și anticorpi de referința.

Articolul 18

ELISA

a) Godeurile din placa de microtitrare sunt captusite peste noapte cu dilutii stabilite de fracțiuni de imunoglobuline purificate provenite din seruri de referința.

b) După spalarea godeurilor cu tampon fosfat salin - PBS-Tween 20, virusul care trebuie identificat este pipetat în godeuri în trepte de dilutie din 2 în 2 sau din 4 în 4 și se lasă sa reactioneze cu anticorpii ce captusesc placa, timp de 60 de minute la 37°C. După spalare cu tampon PBS-Tween 20, sunt adaugati anticorpii a căror specificitate corespunde cu cea a anticorpilor ce captusesc godeurile și se lasă sa reactioneze 60 de minute la 20°C. După o alta spalare ca mai sus se adauga streptavidin conjugat cu peroxidaza din hrean - HRP - și se lasă sa reactioneze pentru o ora la 20°C. După ultima spalare, enzima legată este vizualizata folosindu-se un substrat ELISA corespunzător.

c) Reactia ELISA de mai sus cu biotina-avidina este un exemplu. Pot fi folosite și alte tipuri de ELISA cu eficienta dovedită.